Problème de sélection de plasmide

[invite27b05bf3]

Bonsoir à tous,

Je travaille actuellement sur les plasmides et notamment le clonage. Pour différencier les plasmides recombinants de ceux qui ne le sont pas j'utilise deux gènes de résistances un à l'ampicilline et l'autre à la tétracycline. Je voudrais insérer mon ADN dans la séquence codant pour la tétracycline, mais je ne sais pas quel milieu utilisé pour différencier les plasmides qui contiennent le gènes d’intérêt.
Pour les plasmides recombinants les cellules sont amp r et tet s
Si j'utilise un milieu avec uniquement de l'ampicilline je ne devrais avoir aucune sélection et si j'utilise un milieu avec de la tétracycline je vais perdre mes cellules d’intérêts.

Comment faire ?
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[inviteab824ce2]

Hum...tu fais ta culture sur milieu Ampi, pour sélectionner les intégrations plasmidiques, et ensuite tu fais une empreinte sur velours sur milieu Ampi/Tet. Tu repères celles qui n'ont pas poussé sur ton milieu Ampi/Tet mais qui sont présentes sur ta première boite Ampi seule...tu sauras lesquelles portent le plasmide porteur de ton insert d'intérêt. ^^

[invite27b05bf3]

Je vois Donc si j'ai bien compris il faut mettre un filtre sur la boite contenant le milieu amp. Après la période d'incubation on le retire et on le place sur le milieu tet ? Et par comparaison on peut trouver où se trouve les colonies d’intérêt pas comparaison.

Juste pour info, le filtre doit se trouvé entre le milieu et les colonies où sur les colonies?

[inviteab824ce2]

Non c'est pas vraiment comme ça que cela se passe....je suis étonné que tu ne l'ais pas croisé dans tes cours. Les profs de génétique aiment bien les méthodes à l'ancienne en général.

-En fait, tu lances ta culture sur ta boite Ampi, environ 24h après lorsque tes colonies sont assez grosses tu peux faire ton empreinte.
-Alors il te faut un morceau de velours, un cylindre de diamètre légèrement inférieur à celui de ta boite de culture, un élastique et une boite Ampi/Tet.
-Donc tu poses ton velours sur l'un des face du cylindre, tu utilises ton élastique pour le maintenir.
-Ensuite tu poses la face velours de ton cylindre sur ta boite avec ta culture +24h Amp, tu n'as pas besoin de presser fort. Ensuite tu poses ta face velours de ton cylindre sur ta boite Ampi/Tet, et voila ton empreinte est faite. (Fais-toi des marques avec un feutre sur tes boites pour repérer le sens de ton empreinte.)
-Tu peux attendre au moins 24h, et ensuite tu compares tes deux boites, et tu pourras déterminer quelles sont les colonies qui sont AmpR et TetS, de fait portant le plasmide recombinant.

[A voir en vidéo sur Futura]