comment cloner une enzyme extraite d'une cellule animale?

[inviteb3050c1d]

Bonjour,

j'ai purifiée une enzyme à partir des cellules d'un insecte dont le génome n'est pas séquencé et je voudrais réaliser le clonage de cette enzyme. Pouvez-vous m'aider concernant la démarche à suivre? merci d'avance pour vos réponses
-----

[side311]

Bonjour,

La seul solution à mes yeux c'est que tu récupère la séquence ADN de départ et que tu l'insert par un vecteur de clonage.

Alors si tu as l'ARN tu fait une rtPCR et tu réutilise ton ADNc en PCR puis tu le met dans un plasmide et zou direct dans une bactérie (type: E.coli DH5alpha). Si tu n'as que l'enzyme sous forme protéique alors rajoute une étape de séquençage de ton enzyme et de création de l'oligo correspondant (mais c'est la galère...).

Cela est réalisable avec des moyens techniques et financiers conséquents... sinon je vois pas...

[Gunkan_Jima]

bonsoir,

D'accord avec side311, je veux juste apporter quelques précisions.
As tu la séquence protéique??? si oui (mais j'en doute) tu peux directement faire un gène de synthèse optimisé.
Sinon, tu as deux choix, si tu as identifié la famille de ta protéine, cherche des homologues insectes dans les banques de données, fais une retrotranscription des ARNm avec un polyT, puis à l'aide d'une amorce semi spécifique (designer pour coller à qqchose qui ressemble aux protéines homologues identifiées) tu fais une PCR et tu clones...

L'autre solution, très délicate, c'est de faire une banque de cDNA...

Gunkan

[inviteb3050c1d]

Bonjour,
merci pour vos réponses qui m'aident beaucoup. Aussi quelques recherches m'ont permis de voir que je pouvais aussi explorer la voie de la protéomique puisque je ne connais pas la séquence protéique. pouvez-vous m'aider concernant cette méthode?

[A voir en vidéo sur Futura]

[Gunkan_Jima]

Bonsoir,

Et bien tu peux soit partir sur du séquençage par la dégradation d'Edmann (qui ne te donnera au moins le fragment N terminal, suffisant pour designer une amorce pour amplification du cDNA), soit tu as du séquençage par masse (séquençage direct et/ou avec digestion)

Voilà, mais dans ces deux cas, obtenir la séquence complète peut être difficile (il faut quand même assez de produit et c'est assez cher)... d'où mon insistance pour obtenir un fragment n-ter et rétrotranscrire, puis amplifier via un polyT et ton amorce spécifique N-ter, cloner dans un plasmide et hop là (en espérant que l'ARN messager soit bien rétrotranscrit, et que la PCR se passent bien...)

Bon courage,

Gunkan

[inviteb3050c1d]

merci Gunkan !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

[Gordak]

Salut
Je te conseillerais de tout de même faire une analyse par spectrométrie de masse, afin de déterminer la présence de modifications post-translationnelles. Si il y en a, il faudrait opter pour un autre système d'expression à mon avis.

Gordak