Utilisation du FACS

[invitef08e6467]

Bonjour à tous ,

J'ai vu de nombreuses discussions ouvertes à propos de FACS et j'ai quelques questions assez précise (il me semble).

Je vous explique : j'envisage de mener un suivit de populations hémocytaires (cellules immunitaires) au cours de l'infestation de mon modèle (un escargot) par un parasite. avant ça je vais mener pas mal de manip afin de mettre au point la technique (logique). Je bosse avec un labo qui possède un cytomètre et mon chef a déjà fait un test (oui je suis doctorant au fait). J'ai différents problèmes et quelques interrogations... La labo avec qui on bosse n'a jamais fait sur cellules eucaryotes, ils ne bossent que sur des bactéries. Ils nous ont proposé un marquage SYBR green, première question est ce mieux que l'iodure de propidium?? j'imagine que oui puisque si j'ai bien compris, le SYBR green permet de cibler l'ADN ou l'ARN, me trompe-je??
Ils nous ont aussi conseillé de fixer nos cellules soit en formol 2% soit en PAF 4% et de congeler azote liquide pour conserver. J'imagine bien évidemment qu'il faut rincer les cellules fixées avant de les congeler... La congélation est elle obligatoire, j'ai fait de l'immunoloc sur cellules et je n'ai jamais congelé j'ai toujours conservé mes préparation à 4°... L'idée étant de pouvoir récupérer et stocker le matériel pour n'aller qu'une fois à la machine en fin de cinétique d'infestation.

Si jamais l'un d'entre vous a déjà travaillé sur cellules et qu'il peut m'aider un peu je lui en serait très reconnaissant.

Par avance merci.
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[Flyingbike]

on peut faire des millions de trucs avec le FACS. Quel est votre but ?

[invitef08e6467]

Ah beh oui pardon!!!

Alors l'idée c'est qu'en morpho et avec une coloration MGG j'ai discriminé 4 populations hémocytaire avec des tailles, des noyaux et des granulométries différentes. N'observant pas de prolifération hémocytaire suite à une infestation parasitaire on se demande si il n'y aurait pas une différentiation au niveau de ces populations faisant varier la proportion de chaque famille sans modifier le nombre total d'hémocytes. On arrive a discriminer quatres population en FACS (taille/fluo apres marquage SIBR green) et on a également un anti-corps qui marque une sous population en particulier. On aimerait donc avoir un suivi du nombre de cellules par famille au cours de l'infestation.

Je sais pas si je suis clair?

[invite513ac0a6]

C'est sur combien de temps ta cinétique? Le problème de tout ce qui est fixation/congélation/décongélation, même si c'est fait proprement, c'est que ca peut pas mal modifier les paramètres de taille/structure, vu que ca a l'air d'être votre principal critère de discrimination des différentes populations c'est un peu gènant, donc ce point là est à controler. Il y a pas moyens de bosser sur des cellules fraiches en adaptant un peu le design de ta manip?

Autre question peut être un peu bête, vous avez vérifié que les populations que tu observes en coloration MGG (sur cytospin j'imagine) sont les mêmes que celles que tu vois en cytométrie?

Enfin bon courage, j'imagine que tu dois pas avoir des masses d'anticorps commercialement disponibles pour bosser sur l'escargot

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitef08e6467]

Salut,

Ma cinétique se déroulerait sur 40 jours et ça va être très difficile de le faire sur cellules fraiches. D'où la mise au point d'une methode de fixation/congélation la moins dénaturante possible. D'après ce que j'en sais la congélation à l'azote liquide devrait vitrifier l'eau ce qui n'endommage pas les cellules au moment de la décongélation mais c'est vrai que j'ai quand même quelques craintes.

Question pas bête du tout, on n'a pas encore vérifier qu'on observe les mêmes pop entre MGG et FACS (pas besoins de cytospin mes cellules sont adhérentes) mais c'est vrai que c'est encore un truc qu'on compte faire, l'observation nous a quand même montré de très grandes variations dans la taille.

Et non pas d'anticorps commerciaux malheureusement et celui que l'on a développé (de manière fortuite) nous semble intéressant pour une pop en particulier.