Histologie. Coupes flottantes

[invite03327135]

Bonjour à tous,

Actuellement en stage de neurosciences, je travaille sur la souris à des stades très précoces (entre les jours post-nataux P1 et P20).
Je travaille sur coupes flottantes (50 microns) et j'ai de grosses difficultés à mettre sur lames les coupes de cerveaux des souris les plus jeunes (P1 à P7). Le tampon que j'utilise pour mes rinçages est le PBS1X-triton 0,1%. (Je fais des marquages en fluorescence et en visible: DAB).

Quelqu'un a-t-il eu des soucis pour étaler sur lames de telles coupes? Je suis preneuse de tous vos bons conseils!

Merci beaucoup.
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[invite02e16773]

Salut,

A 50um, tu coupes au vibratome je suppose ?

Est-ce que tu inclues tes cerveaux en agarose avant de couper ?
Si tu ne le fais pas, c'est la solution la plus simple pour ne pas abîmer tes coupes et ensuite les monter au pinceau.

[invite03327135]

Bonjour et merci pour cette réponse

Alors je fais mes coupes au cryostat sans anti roll. Je sais que pour des coupes de 50microns le vibratome serait plus adapté.
Mes cerveaux après prélèvement sont post-fixés une nuit en PFA4%, enrobés dans une solution de sucrose 30% une nuit puis inclus en OCT pour être conservés à -80°C avant de les couper.

Je suis en train de réfléchir à ma méthode de coupes. A savoir si je continue à travailler sur des coupes flottantes ou si je monte mes coupes sur lame. Chaque méthode possède ses avantages et ses inconvénients mais peut être aurais-je moins de pertes en choisissant de monter mes coupes sur lames directement au cryostat?

Bonne soirée.

[inviteb3a6feac]

Bonjour

Le cryostat n'est pas du tout adapté pour ce que vous décrivez.
Comment je ferais:

Prélèvement du cerveau
Fixation PFA 4% overnight à 4°C
Inclusion en agarose 1.5% low melting (température inférieure à 40°C pour ne pas bousiller les épitopes lors de l'inclusion)
Découpe au vibratome 50µm en vitesse lente (2) et fréquence moyenne (5).
prélèvement au pinceau,
Dépôt des coupes de cerveau dans des puits pour procéder à votre protocole d'IHC en faisant 3 wash au PBS 1X au préalable.

Attention en dessous de P5 les tranches seront fragiles.
Pensez à laisser votre IHC sous agitation lors des différentes phases.

Cordialement
Nowell

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite02e16773]

Bonjour

Le cryostat n'est pas du tout adapté pour ce que vous décrivez.

Pas "du tout", c'est un peu fort ... Si ses anticorps marchent au cryostat en OCT, rien ne dit qu'ils vont marcher sur coupes au vibratome en agarose... Changer complètement de méthode d'IHC peu demander pas mal d'ajustements...

Prélèvement du cerveau
Fixation PFA 4% overnight à 4°C

Ca dépend du stade. Après P0/P1 il faut perfuser, ou la fixation n'est jamais suffisante et les IHC/ISH seront moches, voire ne fonctionneront pas du tout.

Inclusion en agarose 1.5% low melting (température inférieure à 40°C pour ne pas bousiller les épitopes lors de l'inclusion)

Ce n'est pas nécessaire. De l'agarose non LMP fonctionne aussi bien, et ça coute moins cher. Il faut juste ne pas le mettre juste après qu'il bout / qu'il y a encore de la fumée, mais sinon c'est bon. D'ailleurs pour les in situ c'est obligatoire, car le LMP est trop fragile.
Par contre il faut en prendre un qui marche pour l'histo, pas de l'agarose de qualité biologie moléculaire (pour les gels).

Découpe au vibratome 50µm en vitesse lente (2) et fréquence moyenne (5).

Je pense que la vitesse dépend des appareils, idem pour la fréquence. Ce sont souvent des échelles non absolues.

prélèvement au pinceau,
Dépôt des coupes de cerveau dans des puits pour procéder à votre protocole d'IHC en faisant 3 wash au PBS 1X au préalable.

Pas besoin de faire de rinçage après la coupe. Par contre, il faut absolument en faire avant l'inclusion pour bien passer en PBS jusqu'au coeur du tissu pour qu'il ne soit pas déformé (plein de lavages dans de gros volume, ou un quelques lavages rapide + un lavage ON + quelques lavages rapides).

Attention en dessous de P5 les tranches seront fragiles.

Il faut bien mélanger (avec un cure dent, par exemple), les cerveaux lors de l'inclusion en agarose pour que le PBS qui reste autour du cerveau se dissolve bien dans l'agarose, et que ce dernier épouse bien les formes du cerveau. De cette manière, les coupes restent bien "dans" l'agarose.

Pensez à laisser votre IHC sous agitation lors des différentes phases.

Agitation à faible vitesse. Sinon les coupes se cassent.


Dans tous les cas, essaies avec des sauvages avant de passer à des échantillons précieux

[invite03327135]

Merci pour vos réponses. Je prends notes de toutes vos remarques.

Pour le moment mes marquages ( Immuno-DAB et hybridations in situ) marchent bien c'est juste que mes coupes sont difficiles à manipuler. Je pense qu'a cet age, et d'après vos commentaires, que c'est normal.
J'ai à disposition un vibratome au laboratoire. Je vais donc essayer cette méthode et voir si elle est plus adaptée à mes échantillons.

Merci encore pour vos réponses!