bonjour à tous
si quelqu'un pourrait m'aider
j'ai un problème que je n'arrive pas a trouver depuis plusieurs jours


voici l'énoncé du TP :

preparation extrait protéique:
-introduire sable et polyvinylpyrolidone
-ajouter 8ml de milieux d'extraction (tampon tris-hcl 25mM ph 7.5, EDTA 1mM, cystéine 10mM, albumine de boeuf stérique 10g/l, DTT 1mM, leupeptine
10microM, FAD^+ 20microM, ph 8,5)
-peser 2g de jeunes feuilles et les mettre dans le mortier en les coupant en petits morceaux avec paire de ciseaux. broyer finement et rapidement.
-filtrer le broyat sur une toile à bluter et rincer le mortier avec 2ml de milieux d'extraction: le filtrat est récupéré dans un tube de centrifugation
préalablement placé dans la glace
-centrifuger les extraits à 10000 rpm durant 20min à 4°C
-recupere les surnageants dans une éprouvette, mesurer les volumes et placer les extraits dans la glace.

principe du dosage des nitrites:
2 reactif seront utilisés: le sulfanilamide et le NED
en milieu acide, le sulfanilamide donne du sulfanilate de sodium et un ion ammonium. les ions nitrites reagissent avec le sulfanilate de sodium en donnant un
ion diazoniium qui en présence de NED donne un composé azoique naphtalenique de couleur rose qui absorbe à 540nm.

relation entre absorbance et quantité de nitrite (gamme étalon):
la gamme étalon et les points expérimentaux étant réalisés dans les même volumes réactionnels (4ml finaux), les absorbances sont à la fois proportionnelles aux concentrations et aux quantités de nitrites présentes dans le milieu réactionnel

réactif prises (ml)
tris-Hcl 25 mM 3.5 3.3 3 2.5 2 1.5
nitrates 30mM 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
nitrites 0.05 mM 0 0.2 0.5 1 1.5 2
tableau 1 (volumes des réactifs à introduire)

-ajouter dans chaque tube 1ml de sul.... à 1% (dans hcl 1.5N) et agiter; puis introduire dans chaque tube 0.3ml de NED 0.1% et agiter
-attendre au min 20 min avant de faire la lecture au spectrophotomètre à 540nm
-utiliser le tube ne contenant pas de nitrite pour faire le Zéro d'absorbance.

mesure de l'activité nitrate réductase:
pour extrait plante cultivées lumière, préparer 6 tube à hémolyse correspondant temps 0, 5,10,15,20,25 min et introduire dans chaque tube:
2ml de tampon tris-HCL 25 mM, PH7.5
0.5ml de nitrate 30mM
1ml de nadh 0.8mM
-agiter et mettre bain marie à 30° pendant 5min
-commencer la cinétique par le temps d'incubation le plus long, soit 25 min. déclencher la réaction enzymatique par introduction de 0.5ml extrait protéique;
agiter et replacer le tube à 30°
-a la fin de la cinétique arrêter chaque réaction avec 1ml de sul..( à 1% dans HCL 1.5N) pour le temps 0, arrêter réaction immédiatement après ajout de l'
extrait protéique. finir par introduction dans chaque tube 0.3 ml de NED et agiter.
-attendre au min 20min avant de faire la lecture au spectrophotomètre à 540nM; la coloration violette est stable par la suite.

-pour l'activité nitrate réductase des plantules développées à l'obscurité, procéder de même mais ne faire que les temps 0, 15,25 min de la même manière.
-utiliser le temps 0 de la cinétique pour faire le 0 d'absorbance (présence cofacteur)


voici donc mon problème :

1) il faut calculer la concentration et la quantité de nitrite dans chaque tube de la gamme étalon et compléter un tableau en précisant l'unité
réactif prises (ml)
tris-Hcl 25 mM 3.5 3.3 3 2.5 2 1.5
nitrites 0.05 mM 0 0.2 0.5 1 1.5 2
concentration NO2-() ? ? ? ? ? ?
Quantité NO2-() ? ? ? ? ? ?
et il faut détaillez un calcul aussi
(?)= valeur à mettre dans le tableau après avoir détaillé un des calcul

La réaction catalysée par la nitrate réductase est :
NO3- + NADPH + H+ -------> NO2- +NADP+ + H2O

merci de l'aide que quelqu'un pourrait m'apporter