Bonjour à tous
Je suis étudiant en première année de Master 1 de microbiologie et j'ai un sujet de TP à réaliser. Je souhaiterais savoir si mon protocole vous convient :
Je vous remercie
Isolement de souches productrices de Béta galactosidase à partir de la saucisse fumée*:
→ caractérisation phénotypique
→ caractérisation génétique
I) caractérisation phénotypique
1) Obtention de la solution mère :
broyer la saucisse fumée afin d'obtenir des morceaux par solubilisation
diluer le jus obtenu dans de l'eau distillée pour réaliser la suspension mère
2) TEST ONPG: ( caractérisation génétique )
vérifier que la solution mère contient de la Béta Gal*:
→ faire le test ONPG*: si jaune → présence de Béta Gal
si blanc → absence de Béta Gal
3) Ensemencement sur boîte de Pétri sur milieu lactosé*:
si test positif → faire un ensemencement en surface sur gélose Kliger / Baird – Parker / VRBL
les bactéries qui poussent possèdent la Béta Galactosidase ( capables d'utiliser le lactose comme source énergétique)
4) Isolement des bactéries:
reprendre les bactéries qui ont poussé pour ensuite les caractériser
II) caractérisation génétique
Identification de la bactérie responsable de la production de béta galactosidase*:
Recherche de la bactérie*: basée sur la présence de l'ARN16S (universel chez toutes les bactéries) – méthodes moléculaires
1) lyse bactérienne et extraction de l'ADN*:
→ Fragilisation enzymatique ( lysozyme ) ou détergents
2) Trouver des amorces spécifiques pour la PCR*:*(obtenir une quantité suffisante d'ADN )
→ faire des témoin T+ et T-
→ PCR*: gel d'électrophorèse en gel d'agarose
3) Séquençage du produit amplifié*: méthode de Sanger / pyroséquençage
→ obtention d'un chromatogramme ( séquence de bases nucléotidiques)
4) Analyse informatisée des séquences*:
→ Site utilisé NCBI → Blast → nucleotide Blast
-----