Cytométrie de flux, espèces, isotypes...

[invite81deef39]

Bonjour à tous,

Ceci est mon premier message sur ce forum. J'espère trouver réponse à mes questions.

Je suis étudiant en Master 2, je souhaite marquer des cellules (humaines) pour les doser en cytométrie de flux, et j'ai eu deux réponses à ma question au labo, alors je voudrais vous demander votre avis: est-ce que tous les Ac doivent provenir d'espèces différentes et être d'isotypes différents? Plus précisément, si j'ai deux Ac Mouse IgG1, est-ce que c'est très grave?

Mon marquage:
CD14 AlexaFLuor Ms IgG1
VEGFR2 PE Ms IgG1
CD144 APC Ms IgG2B
CD34 FITC Ms IgG2A

Autre question bonus: est-ce que je suis obligé de faire un tube avec chaque marquage et un tube avec le marquage quadruple, ou je peux me contenter d'un tube avec le quadruple marquage?

Merci!
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[invite513ac0a6]

Bonjour à tous,
est-ce que tous les Ac doivent provenir d'espèces différentes et être d'isotypes différents? Plus précisément, si j'ai deux Ac Mouse IgG1, est-ce que c'est très grave?

Aucun soucis dans ton cas à ce que les Ac proviennent de la même espèce/soient le même type d'Ig étant donné que tous tes Ac sont directement conjugués à un fluorochrome. Il faut juste faire gaffe dans les cas où tu utilises des Ac non conjugués nécessitant un marquage secondaire, pour éviter que ton Ac secondaire n'aille se fixer à 2 Ac primaires différents, enfin c'est juste de la logique de marquages immuno que ce soit pour du facs ou de l'ihc.

Bonjour à tous,
Autre question bonus: est-ce que je suis obligé de faire un tube avec chaque marquage et un tube avec le marquage quadruple, ou je peux me contenter d'un tube avec le quadruple marquage?

Il te faut évidemment des contrôles mono-marqués (en plus des contrôles non marqués ou marqués avec isotype controle), par contre c'est pas nécessaire de le faire pour chaque échantillon, c'est juste pour régler les PMT et compensations. Un autre type de contrôles nécessaire quand tu recherches des populations rares et/ou dans le cas d'un marqueur pour lequel la positivité est un léger shift d'intensité de fluoresence par rapport au marquage isotype ctrl sont les FMO (Fluorescence Minus One), où tu mets tous les Ac sauf un que tu remplaces par son isotype ctrl adequat.