question de qPCR pratique avec exemple

[invite0523b085]

Bonjour à tous !

j'ai cherché un peu partout sur les forums concernant le choix des amorces de qPCR et je ne trouve pas ma réponse.
je sais que le pourcentage de GC doit être le plus élevé possible (pour la spécifité ) mais je ne sais pas ce qu'il en est concernat la distance des amorces: (pour sybergreen)
-les deux amorces doivent elles etre les plus éloignées possible ? ou les plus proches possible ? (pour eviter la contamination avec l'ADNg ???)
je vous joins 3 couples d'amorces si vous pouvez m'expliquer pourquoi vous choisiriez l'une ou l'autresimplement ce serait super ! merci beaucoup

Primer Information

Gene Name: Gcg RefSeq ID: NM_008100 Chromosome: chr2 Strand: -

Transcription: 62422289-62413166 Number of introns: 5

Right primer sequence: TGCCTTGCACCAGCATTAT Position: 152 Length: 19 GC%: 47.368 Tm: 60.235

Left primer sequence: TGTCTACACCTGTTCGCAGC Position: 55 Length: 20 GC%: 55 Tm: 60.056

cDNA amplicon size:98 Estimated genomic amplicon size:3095 in silico PCR

Right primer sequence: TCCTCTGTGTCTTGAAGGGC Position: 183 Length: 20 GC%: 55 Tm: 60.386

Left primer sequence: TGTCTACACCTGTTCGCAGC Position: 55 Length: 20 GC%: 55 Tm: 60.056

cDNA amplicon size:129 Estimated genomic amplicon size:3126 in silico PCR

Right primer sequence: TGGGGTTCTCCTCTGTGTCT Position: 191 Length: 20 GC%: 55 Tm: 59.682

Left primer sequence: TGTCTACACCTGTTCGCAGC Position: 55 Length: 20 GC%: 55 Tm: 60.056

cDNA amplicon size:137 Estimated genomic amplicon size:3134 in silico PCR
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[invitec4829296]

Bonjour,

un petit truc en + : il faut essayer de finir par 3 G/C (CGG, GCG,CCC,etc.) pour améliorer l'accroche de l'amorce en 3' et facliter le démarrage de la PCR.

Ensuite, si tu es en real-time qPCR, il est conseillé d'avoir un amplicon court 100-200 pb pour être sûr de répliquer l'ensemble de la séquence à chaque cycle de PCR.

Le pourcentage de GC n'a rien à voir avec la spécificité, il sert à obtenir un Tm élevé. En effet, tu peux avoir 2 séquences proches (gènes orthologues) avec un fort pourcentage de GC.
Pour vérifier la spécificité des amorces, il faut savoir s'il existe d'autres gènes ayant une séquence proche du tien avec BLAST et vérifier que tu n'as pas positionné ton amorce dans des zones conservées (i.e. qui présente un fort pourcentage d'identité). Je crois même que maintenant qu'il existe un programme BLAST spécial pour tester directement ton amorce contre l'ensemble du génome.

Il faut également vérifier que tes amorces ne se replient pas en épingle à cheveux (ou hairpin) grâce à des logiciels spécialisés. Il y en a sûrement en ligne.

Bonne continuation

[invite0523b085]

merci pour votre réponse, mais ma question était surtout
-les deux amorces doivent elles etre les plus éloignées possible ? ou les plus proches possible ? (pour eviter la contamination avec l'ADNg ???)
je vous joins 3 couples d'amorces si vous pouvez m'expliquer pourquoi vous choisiriez l'une ou l'autresimplement ce serait super ! merci beaucoup