Carte de restriction de Pcr-GAI

[invite13e4bad5]

Bonsoir,
Je dispose du plasmide Pcr-GAI avec les sites de restriction suivants (voir image).
Notre TP consistait à récupérer la moitié 5' du gène GAI puis de l'insérer dans un autre plasmide. Pour vérifier si le plasmide recombinant est le bon, il est nécessaire d'améliorer la carte de restriction du plasmide Pcr-GAI en trouvant le site de restriction de XhoI et celui de BglII sur le gène GAI.
Nous disposons de 4 enzymes : EcoRI, HindIII, XhoI et BglII, pour faire les digestions nécessaires.

Je vous propose mon mode opératoire:
- digestion du plasmide Pcr-GAI par EcoRI pour libérer le gène GAI du reste du plasmide, électrophorèse et récupération du fragment qui a le plus migré (petit poids moléculaire).

Sur le gène GAI on a un site de restriction pour HindIII qui est situé au centre de la séquence. On garde une certaine quantité de gène GAI et on digère le reste avec HindIII pour récupérer deux fragments de même taille (par contre je ne sais pas comment différencier les deux fragments (5' et 3'?).

Finalement on teste séparément les deux enzymes restantes sur le fragment pour voir s'il y a des séparation.

On met ensuite le gène GAI en entier en présence des deux enzymes (XhoI et BglII) et on compare les fragments obtenus avec les produits de digestion des moitiés 5' et 3'.

Le mieux serait d'isoler la moitié 5' mais je ne vois pas comment faire.

Bon le protocole reste assez complexe donc je ne sait pas trop si c'est possible :/.

Merci d'avance pour votre aide.
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[piwi]

Bonsoir

Pourquoi ne pas faire:
1. XhoI/HindIII pour faire sortir le fragment 5´
2. Purification du fragment
3. Digestion BamHI pour nettoyer le fragment et ne conserver que l'ORF d'intérêt.

Cordialement
Piwi

[invite13e4bad5]

Bonsoir,
Merci de votre réponse, en fait le problème c'est que je ne dispose pas de l'enzyme BamHI et que si XhoI est placé sur la moitié 5' du GAI on obtiendrait deux fragments; mais c'est sûr que ce serait beaucoup plus pratique pour récupérer le fragment 5'. Et si je remplace BamHI par EcoRI? Le fragment ne sera pas pur à 100% mais reste le moins "contaminé" par le vecteur. Par contre j'ai une question, comment savez vous que la partie gauche du GAI est la partie 5'?

[piwi]

Dans ce cas, je n'avais pas vraiment lu l'énoncé, le plus simple est encore de faire une digestion HindIII, pour libérer le fragment 3' (894 pb), que vous ne conserverez pas. Avec le reste du plasmide (4590 pb), une digestion EcorI fera sortir le fragment 5' avec 8 nucléotides du plasmide (753 pb). Je ne vois pas quoi faire de mieux avec les conditions que vous avez.
En revanche, n'oubliez pas que vous devez déjà améliorer la carte de restriction au préalable. Vous n'en parlez pas dans votre texte.

Cordialement,
piwi

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite13e4bad5]

Bonjour,
Justement j'en parle au tout début du texte .

Bon apparemment on dispose de BamHI donc dans ce cas on peut libérer le 5' GAI en utilisant HindIII et BamHI et ensuite le faire digérer séparément par XhoI et BglII si on obtient deux fragments par digestion, on a les deux sites de restriction sur le 5' GAI (donc dépend d'un coup de chance) sinon il faut (pour améliorer la carte de restriction) obligatoirement isoler le 3'GAI avec EcoRI et HindIII et le mettre en contact avec l'enzyme dont on cherche encore le site de restriction.

Le problème suivant est de placer les sites de restrictions sur le GAI: imaginons que l'on a 2 fragments sur la moitié 5', un de 200pdb et l'autre de 545pdb (l'addition fait 745 soit la moitié 5') on a un site de restriction mais comment le placer? Car on peut partir de 5' vers 3' ou de 3' vers 5'. J'imagine qu'il y a une autre digestion a faire et je me demande s'il ne faudrait pas prendre le pCR-GAI en entier et le faire digérer séparément par XhoI et BglII ?
Merci d'avance.

[piwi]

D'une manière générale, je pense qu'il faut de la méthode et ne pas se prendre trop la tête avec les restrictions.
d'abord les digestions simples et ensuite les doubles. Inutile de sortir l'insert avant de commencer à faire la carte, le vecteur, en donnant de gros fragments va vous aider.

1. XhoI seul
2. BglII seuls
3. XhoI + NglII
4. BglII + HindIII
5. XhoI + HindIII

Avec ça, vous devriez être en mesure de savoir où se situent vos sites de restrictions cryptiques sur votre gène.

Cordialement,
piwi

[invite13e4bad5]

J'ai peut être oublié de préciser que je n'ai jamais établi de carte de restriction ^^'. En fait je ne vois pas du tout comment placer les sites de restriction rien qu'en regardant une électrophorèse...Car finalement on aura des fragments de différentes tailles à mettre bout à bout mais dans quel sens...

Sinon je suis d'accord avec vous pour les 3 premières digestions qui sont tout à fait logiques. Par contre pour les deux dernières, on utilise HindIII pour couper le GAI en deux c'est bien ça ?