Binding tests sur enzyme

[invite91c8de42]

Bonjour,
Etudiant en master Bio, je recherche des informations sur les tests de binding pour un screening HTS. La cible est une enzyme de l'appareil de Golgi.

Je sais qu'il est possible de faire un test d'activité (mesure de l'activité de l'enzyme en présence des molécules inhibitrices) mais j'ai l'impression que ce test est difficile à mettre en place et assez coûteux (pour tester des milliers de molécules). Je sais qu'il est cependant nécessaire pour définir certains paramètres (donc à utiliser sur les molécules qui ont passés les tests de binding).

J'ai aussi pensé à utiliser les tests de binding "classiques" mais il faut que les protéines soient membranaires. J'ai donc cherché comment amener mon enzyme à la membrane (création d'une protéine chimère), mais je ne trouve rien. Il doit pourtant exister un vecteur avec une séquence signal et une suite d'acides aminés aliphatiques permettant l'expression membranaire de mon enzyme?

Sinon connaissez-vous un autre test de binding? si possible relativement peu coûteux et permettant de travailler avec un grand nombre de molécule sur une ?
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[vpharmaco]

C'est amusant car j'ai l'impression que toute personne faisant du screening rêve d'avoir a travailler sur une enzyme soluble. Un test d'activité enzymatique est ce qu'il y a de plus simple et de moins cher a developper lorsque c'est possible (et cela l'est encore plus si le test est déjà au point).
Un test de binding sur cellule entière ou sur membrane isolée, c'est des étapes et des étapes (lavage, fixation...), des soucis de reproductibilité avec des lots de cellules qui vont produire plus ou moins de protéines, des soucis de sensibilité avec beaucoup de non-spé lié a l'absorption des molécules aux membranes...
D'ailleurs, comment envisages tu détecter le binding de tes petites molécules sur ta protéine membranaire ????

Sinon connaissez-vous un autre test de binding? si possible relativement peu coûteux et permettant de travailler avec un grand nombre de molécule sur une ?

Un test de binding assez élégant (avec bien évidemment ses avantages et inconvénients...) est le thermal shift assay.

[invite91c8de42]

Merci pour la réponse!
Oui un test est déjà mis au point pour cette enzyme, donc en fait, c'est les conditions idéales

D'ailleurs, comment envisages tu détecter le binding de tes petites molécules sur ta protéine membranaire ????

En fait, je n'y avais que peu réfléchit, vu que la technique est décrite un peu partout, j'avais l'impression que c'était assez facile à mettre en place.

Et merci pour le thermal shift assay, ça m'a l'air bien comme technique et je vais aller la découvrir!