Enzymes Taq Polymérases - PCR

[invite85790560]

Bonjour,
Je crois avoir compris certaines informations mais je voudrais être sûre ...
La Taq Polymérase a une température de polymérisation de 72°C, c'est pourquoi lors de l'élongation (3° étape de la PCR) la température est élevée à 72°C.
La Taq Polymérase est une enzyme "Hot Start", c'est à dire qu'elle est équipée d'un inhibiteur qu'il faut préalablement enlever lors de la dénaturation.
Cet inhibiteur se détache de l'enzyme à une température de 95°C.
C'est pourquoi, lors de la dénaturation (1° étape), le fait de monter la température jusqu'à 95°C ne met pas en marche cette enzyme, car il faut d'abord "supprimer" l'inhibiteur.
J'aurais à expliquer tout cela dans le cadre d'un TPE donc je préfère être sûre d'avoir compris.
Merci.
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[TanguyE]

Bonjour,

Alors dans l'ordre:

- La température de polymérisation n'est pas toujours de 72°C pour les Taq pol mais si c'est pour donner une idée générale ça me parait correct.

- La Taq pol standard n'est pas une hot-start. En effet certaines Taq du commerce le sont grâce à ce principe de l'inhibiteur qui se détache lors de la première dénaturation à 95°C. En fait le hot-start permet d'éviter toute activité de la taq avant qu'elle ne soit activée, notamment lors de la préparation de la PCR. En théorie, une taq hot-start permet de faire une préparation de PCR à température ambiante sans activer la polymérase, ce qui n'est pas le cas d'une taq standard. En pratique on fait tout sur de la glace à 4°C pour être sûr.

J'espère avoir été assez clair.

[invite85790560]

Merci.
Mais alors, lors de la dénaturation, lorsque la température est montée à 95°C , l'inhibiteur se défait et l'enzyme devient active?
Si c'est le cas, lors des cycles suivants, pendant les dénaturations, la Taq pol sera active?

[TanguyE]

Oui elle est active mais vu que c'est la dénaturation, elle ne pourra rien faire vu que tous les brins d'ADN se retrouvent simple brins et que les amorces ne sont pas encore fixées. (Pour rappel, la taq pol n'a pas de capacité de primase, elle nécessite forcément une amorce).

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite85790560]

Ah, bin oui bien sur ! Merci pour votre aide.