Manipulation des acides nucléiques

[inviteb7174662]

Bonjour,

Je suis une grosse bille en manipulation des acides nucléiques, sans doute à cause de mon esprit recouvert d'oeillères, enfin bref,

J'ai fait un exercice pour m'entrainer un peu, et ...oh my god, je ne comprends rien...

Ca m'aiderait beaucoup si vous pouviez m'expliquer le pourquoi du comment.

Voici l'exercice :

On possède la molécule d'ADN ci dessous :

Brin+: ----------5' G-A-G-G-T-G-G-C-C-A-G-T
Brin-: 3' pC-C-C-C-C-T-C-C-A-C-C-G-G-T-C-A-A-A-A-A-Ap 5'

Quelle molécule obtient on apres dénaturation si on la traite par :
- La polynucléotide kinase + *pppA
- ARN ligase + *pCp
- une phosphodiestérase de rate
- Nucléase S1
- RNAse T1
- DNAse 1

Ce que je pense (et qui est faux, je crois) :
- La polynucléotide kinase transfere un p* sur l'extrémité 5'OH libre en utilisant un *pppA
Or le brin- ne possède pas d'extrémité 5'OH (extrémité 5'p et 3'p)
Peut on considérer que le O- du phostate en 5'p peut être utilisé de la même facon que le 5'OH par la polynucléotide kinase.
Si oui, on aurait donc en 5' du brin- :
---A-A-App*
(déjà je ne suis pas sur du tout de ca ^^)

- ARNligase + *pCp* :
La ARN ligase forme une liaison phosphodiester entre un 5'p et un 3'OH
Or là, même topo, on a pas de 3'OH libre
Je suis perdu
Donc finalement je dirai qu'après traitement avec l'ARN ligase on aurait en 3'p du brin- :
*pCpp-C-C-C-C------
Ca me semble bizarre aussi

- La phosphodiesterase, je n'ai pas d'info sur cette enzyme, je me doute qu'elle coupe la liaison phosphodiester, mais j'ignore si c'est en amont ou en aval du phosphate...

- Bon la nucléase S1 hydrolyse les parties simples brins du brin-

- La RNAse T1 coupe après les G et on obtient des fragments ----Gp en 3' et OH-N---- en 5'

- La DNAse 1 va couper les fragments double brin...

Bon bhé voilà, maintenant que vous avez pu constater la catastrophique étendue de mon savoir sur la manipulation des acides nucléiques, j'espère que vous saurez éclairer un peu ma lanterne.

Je vous remercie d'avance.
-----

[invite9af7ea32]

Bonjour Djelaba,
voici pour commencer un lien qui pourra certainement t'aider:
http://www.biodeug.com/cours/bm23.php
profites en pour naviguer et voir les autres chapitres proposés sur ce lien.
Un autre lien qui peut compléter :
http://daffyduke.lautre.net/docs/bio...ochimie_8.html (surtout le "V. Les principaux types d’hydrolyse chimique des acides nucléiques ")
Ensuite, note que sur ton brin positif ton extrêmité notée " 5'-G... " signifie que tu as une extrêmité 5'OH libre.
En revanche sur ton brin négatif, l'extrêmité " 5'-pA..." est phosphorylée.
Enfin, la polynucléotide kinase est une enzyme capable de phosphoryler des extrémités 5' libres, ou préalablement déphosphorylées via l'action d'une phosphatase.
Note aussi que ta molécule d'ADN dans l'exercice se compose d'une partie double brin et le reste est simple brin...
Je pense que c'est important maintenant que tu tentes de résoudre l'exercice par toi même, tu as les éléments nécessaires avec les liens que je te donne pour y arriver. Courage !
@bientôt.
klam.

[inviteb7174662]

Merci pour ton aide

Mais je dirai oui mais non ^^
Ok, j'ai une extrémité 5'Oh libre sur le brin+, mais la base en face sur le brin- n'est pas complémentaire des nucléotides (pppA ou pCp) à incorporer. Donc, là je bloque.

Je veux évidemment faire cet exercice seul, c'est pour ca que je ne vous ai pas le demander le faire. ^^

J'aimerai juste que l'on me guide dans mon raisonnement, qui a du mal à se débloquer, ou qu'on me mette le nez sur mes erreurs ^^

Merci encore.

[inviteba102254]

bonsoir
il faut réfléchir avant de ce précipiter de poser sa question sur le forum
a mon avis c'est pas a nous de faire cet exercice!

[A voir en vidéo sur Futura]

[Yoyo]

Salut

Ok, j'ai une extrémité 5'Oh libre sur le brin+, mais la base en face sur le brin- n'est pas complémentaire des nucléotides (pppA ou pCp) à incorporer. Donc, là je bloque.

or

La polynucléotide kinase transfere un p* sur l'extrémité 5'OH libre

tout est dit

Yoyo

[inviteb7174662]

A Dna2006 >Ah ah la bonne blague,
Il faut peut être lire le sujet en entier avant de parler, non Oo

J'ai donné dans mon premier exemple mes réponses ou mes problemes... Et j'ai commenté même mes réponses.

De plus, j'ai précisé juste ci dessus, que je ne demandais pas qu'on me fasse cet exercice...Ensuite, ce n'est pas un exercice que je dois faire pour un cours quelconque, je désire simplement parfaire mes connaissances dans ce domaine où j'ai des lacunes, et où je demande des éclaircissements.
Donc garde ta rancune pour toi dna2006, et je te retourne le compliment, tu aurais du lire ce thread en entier et y réfléchir avant de parler. Je prends assez mal ta remarque déplacée et injustifiée, et j'en appelle à la modération, c'est de la provocation gratuite là Oo

Bon sinon, je crois que j'ai un peu mieux cerné le probleme et que tu as raison Klam.
C'est bien le brin+ qui subit l'addition de nucléotides, mais le fait que les bases n'étaient pas complémentaires m'a un peu gêné. Je me rends compte à présent qu'on s'en fout, puisqu'on utilise pas d'enzymes nécessitant une matrice. J'ai bon ?

EDIT : Ooops j'ai écrit mon message pendant que tu postais ta réponse Yoyo. Ok merci j'ai bien pigé le truc, encore une fois j'ai eu une vision trop étroite du truc...

[invite9af7ea32]

bon, un petit coup de pouce :

On possède la molécule d'ADN ci dessous :

Brin+: ----------5' G-A-G-G-T-G-G-C-C-A-G-T
Brin-: 3' pC-C-C-C-C-T-C-C-A-C-C-G-G-T-C-A-A-A-A-A-Ap 5'

Quelle molécule obtient on apres dénaturation si on la traite par :
- La polynucléotide kinase + *pppA

Tu sais que les kinases permettent de fixer un groupement phosphate en présence d’ATP = Adénosine TriPhosphate = pppA . Dans cette molécule d’ATP* (* : signifiant radioactif), le phosphate pris et ajouté en 5'OH est celui situé en position gamma (position la plus externe) de la molécule d’ATP* : le P*. Le groupement phosphate est fixé à l’extrémité 5’ d’un ADN préalablement déphosphorylé.
La kinase catalyse la réaction d'ajout en 5'OH d'un P* qu'elle prend de l'ATP* ! ce n'est pas un ajout de A ! il n'est pas question de complémentarité de base ici !
La kinase n'agissant QUE sur les extrêmités 5'OH libres, tu vois que seule l'extrêmité 5' du brin+ est libre, alors l'ajout du P* est à cet endroit uniquement :
Brin+: ----------5' p*G-A-G-G-T-G-G-C-C-A-G-T
Brin-: 3' pC-C-C-C-C-T-C-C-A-C-C-G-G-T-C-A-A-A-A-A-Ap 5'
Aller courage, prends le temps de lire et procède pas à pas.
@+
klam.

[inviteb7174662]

Rofl je suis vraiment un boulet, merci Klam
Je vais arrêter les études je crois Oo

J'étais parti dans mon probleme de base complémentaire qui n'avait rien à voir avec la choucroute, j'ai honte.

Merci maintenant promis c'est bon, j'ai tout pigé ^^