Probème de smear sur gel d'électrophorèse de protéines

[inviteb7f0a13b]

Bonjour,
J'aurais besoin de votre aide pour comprendre un gel d'électrophorèse de protéines. Ce n'est pas ma manip mais celle d'une étudiant en thèse qui ne parle pas français et qui m'a demandé de l'aide.

La protéine d'intérêt fusionnée en N-terminal à la GST a été exprimée chez E. coli puis purifiée sur résine cobalt (lavage en batch). La protéine de fusion a été clivée à la thrombine. La protéine d'intérêt est éluée par simple centrifugation. La protéine de fusion toujours accrochée à la résine est éluée avec de l'imidazole.
Un gel d'électrophorèse a été effectué (le pourcentage d'acrylamide n'a pas été bien choisi).
Sur la poste correspondant à la protéine d'intérêt (piste 7; 16KDa; flèche noire), il y a quelques contaminants mais surtout un smear remontant vers le haut. On ne retrouve pas ce smear dans l'élution de la GST (piste 8; flèche noire).
Elle a refait une 2ème purification et il y a toujours ce même smear.
En parallèle, elle a aussi purifié 2 autres protéines de la même famille mais issues d'autres organismes et il n'y a pas de smear.

A quoi pourrait-il correspondre?
En quoi pourrait-il affecter un dosage par la méthode Bradford?
Cette protéine est destinée à faire des tests d'activités, cela pourrait interférer dans les tests?

Merci d'avance pour votre aide.

Pistes du gel:
piste 1: bactéries avant induction
piste 2: bactéries après induction à l'IPTG
piste 3: bactéries après sonication
piste 4: lysat après centrifugation
piste 5: protéines non retenues sur la résine
piste 6: fin du lavage
piste 7: élution de la protéine d'intérêt
piste 8: élution de la protéine de fusion
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[invite537c5180]

Salut,
Piste 7; 16 kDa; flèche rouge, tu veux dire. Ok si j´ai bien compris (corrige moi si je me trompe) : la grosse patate sur la colonne 8, c´est la GST et en 7 tu es censé avoir ta protéine d´intéret seule ?
Parce que si c´est bien ça, moi je ne vois rien en 7 ! il y a juste la GST qui a été surproduite (en 8), faudrait peut être qu´elle vérifie sa construction.

[inviteb7f0a13b]

En effet, toutes mes excuses, la protéine d'intérêt correspond bien à la flèche rouge.
La protéine n'est pas bien visible sur la piste 7 (elle est à la base du smear), on peut la voir sur la piste 8 en bas car elle n'a pas tout récupéré lors de l'élution.
Normalement, la construction est bonne, il y a eu un séquençage du vecteur.

[invite537c5180]

Ok, donc si vous êtes sûr que votre protéine d´intéret est bien produite. Les smears sont en géneral dûs á une mauvaise préparation d´un des deux gels (ou des deux) ou encore au dépot d´un volume trop grop de protéines dans les puits du gel.
Voici les volumes géneralement utilisés pour préparer un gel qui permet d´observer des protéines ayant un poids moléculaire compris entre 10 et 200kDa :
11% resolving gel : eau dest 3,71 ml, 4x Resolving Gel Buffer 2,5 ml, 30% acrylamide 3,7 ml, 10% APS 80 µl, TEMED 6 µl
Stacking gel : eau dest 1,43 ml, 4x Stacking Gel Buffer 625 µl, 30% acrylamide 417 µl, 10% APS 25 µl, TEMED 1,9 µl
Si toute fois elle a toujours le même smear après dépôt d´un plus petit volume de protéine éluée et préparation d´un nouveau gel, elle trouvera peut etre la réponse ici (c´est en anglais):
http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/st...ofs/smear.html

[A voir en vidéo sur Futura]