Coucou tous le monde , au fait je vais faire de l'hybridation avec une sonde 16s et une sonde d'un gene de résistance,pour voir si le gene est chromosomique ou non, (puisque le 16s est du chromosome) ,pour la digestion donc j'ai utilisé l'enzyme : Iceu-1 (qui coupe l'adn) mais lors de la migration!! alors tous le profil ètait lisè ,que des smir pour tous les échantillons !!
c'est quoi le prob
Bonjour,
Une clarification : ta sonde 16S détecte la région de l'ADN codant pour la sous-unité 16s rRNA, c'est cela?
Après, si l'expérience est un Southern-Blot (ou équivalent), la fréquence de coupure de l'ADN par l'enzyme doit être assez élevé pour que le profil de digestion soit "lisse". Dans mon ancien labo, on utilisait des enzymes "classique" de type EcoRV, HindIII... Le point difficile étant que la zone de référence (pour toi le 16s) et la zone à tester (le gène de résistance) doivent toujours être détecté (et donc qu'il ne faut pas couper au niveau de la sonde - qui n'est généralement pas excessivement grande --500pb pour moi).
Or Iceu-1 est comme même assez... complexe.
Le site de reconnaissance est super long (je trouve que 27-28 nucléotides de détection, non dégénéré, c'est long - à comparer avec les 6-10 normalement), ce qui signifie une fréquence de coupe de l'ADN faible (donc de plus gros fragments).
Et c'est sans compter sans les notes :
Bref, sauf si j'y suis obligé, je préfererai ne pas utiliser cette enzyme.I-CeuI can remain bound to DNA after cutting and alter migration rate of DNA during electrophoresis. To disrupt binding, add SDS to a final concentration of 0.5% or purify DNA before electrophoresis.
Homing endonucleases do not have stringently-defined recognition sequences in the way that restriction enzymes do. That is, single base changes do not abolish cleavage but reduce its efficiency to variable extents. The precise boundary of required bases is generally not known. The recognition sequence listed is one site that is known to be recognized and cleaved.
Sinon, juste l'ajout de SDS à 0.5% en concentration final peut peut-être aider.
merci pour votre repense, au fait c'est technique de southern blot oui
l'ajout de SDS pendant l'extraction?
Non, cette enzyme a tendance à rester accrocher à son site de coupure. Le SDS va dénaturer l'enzyme, qui va donc se "décrocher". Il faut donc l'ajouter après la digestion et avant la migration de l'ADN.
aah d'accord!! ok , je vais essayè quant meme !! merci
sinon tu pense à une autre solution?
Changer d'enzymes
Mais cela demande du travail et quelques tests.
