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(licence/master) Question sur la pcr pour un rapport de stage, merci




  1. #1
    rajh

    (licence/master) Question sur la pcr pour un rapport de stage, merci

    Bonjour à tous,
    C'est la première fois que j'écris sur votre forum, malgré que j'apprends beaucoup de chose sur ce site.
    Je suis actuellement en master, et dans le cadre de mon rapport qui est porté sur la démarche scientifique. Je dois donc dire les principales méthodes disponibles pour étudier une prévalence avec les avantages et inconvénients dans une région. (hôtes infectés / hôtes totaux recensés). Je travaille sur un genre de parasites qui forme des kystes dans les muscles infectant des bovins.

    On m'a donné 3 publications avec 3 techniques de PCR différente (multiplex temps réel, RAPD, RFLT), et je voulais savoir si ma démarche et les informations recueille sont bonnes.

    Les avantages d'une PCR en général :
    C'est une méthode très sensible, elle permet de travail avec une faible quantité de matériel initial, méthode généralement rapide, et aussi très spécifique.
    Les inconvénients sont une possibilités de contamination en prélèvement les échantillons, une contamination possible pendant la PCR, méthode qui demande de la rigueur et une technicité.



    La PCR-RAPD :
    c'est une PCR utilisant de petites amorces de séquences aléatoires ( 8-12 nucléodites)comprenant (60 à 70% G et C) puis une identification sur gel. C'est un moyen rapide pour identifier plusieurs espèces. C'est une méthode très sensible. Il y a pas besoin de connaitre les génomes.

    La PCR-RFLT :
    C'est une PCR qui permet d'étudier la variabilité d'un gène. On utilise des amorces ciblant un gène homologue sur les différentes espèces puis on utilise une enzyme de restriction puis on compare le profil sur gel. C'est une méthode plus longue que les autres PCR. C'est une méthode très sensible. Il faut une connaissance du génome des parasites ciblés.

    La PCR-multiplex en temps réel :
    C'est une méthode de PCR récentes, qui utilise des amorces spécifiques, elles permettent d'amplifier plusieurs ADN cibles en même temps. L'ADN de chaque amplification est quantifié à tous les cycles par fluorescence spécifique pour chaque ADN cible. Il faut une connaissance du génome des différents parasites. C'est une méthode très rapide. Ils peuvent avoir une spécificité plus réduite à cause de compétition entre les ADN ciblés et des amorces non adéquates.

    Dans mon stage, on a utilisé la méthode de la PCR multiplex à temps réel. On veut effectué une prévalence sur 471 échantillons de bovins. Utilisation de la PCR-RAPD n'est pas adaptée, car il faut une étude au préalable sure de l'ADN pur des parasites et des différentes races de bovins étudiées pour les différencier ensuite.
    La PCR-RFLT est une méthode assez longue et il faut aussi une étude au préalable sur de l'ADN pur des différents parasites. Elle est aussi très spécifique, on pourrait avoir trop de variation et une difficulté interprétation.
    La méthode multiplex- en temps réel est la méthode la plus rapide aujourd'hui. On connaît le génome des parasites donc on peut utilise des amorces spécifiques. Elle permet d'avoir les résultats plus rapidement interprétables. L'inconvénient est que la sensibilité et la spécificité sont plus faibles que pour les autres techniques. C'est la méthode la plus pratique pour une étude de prévalence sur plusieurs échantillons différents.


    Voilà, j'espère que vous pourrez dire si mes informations et mon interprétation sont justes et s’il ne manque pas d'autre information importante.
    Merci beaucoup !!

    Ps : dernière question, la RLFT et PCR multiplex sont utilisé sur de l'ARN 18S, dont il faut mettre dans la solution de PCR du chlorure de magnésium pour utilisé la capacité de la Taq polymérase à effectué une transcription inversée et amplifiée ADN complémentaire ?

    -----


  2. Publicité
  3. #2
    biseibutsu

    Re : (licence/master) Question sur la pcr pour un rapport de stage, merci

    Bonjour,

    Juste pour le néophyte, indiqué la signification des sigles peut aider
    Pour la RAPD, pas de problème.
    Pour la RFLT (une variante de RFLP? restriction fragment length polymorphism) c'est un peu confus. Cette technique permet surtout de voir des différences de tailles dans l'ADN (et plus spécialement les VNTR)
    Pour la Multiplex, un des avantages est également de pouvoir quantifier (car en temps réel). Mais cela demande beaucoup de préparation pour le protocole. Après, au niveau du désavantage, vous avez toute à fait raison. il est cependant possible de diminuer, voir de supprimer cet inconvénient de compétition à l'aide d'optimisation des sondes et du protocole. Mais cela demande généralement beaucoup d'effort pour une faible amélioration.

    Pour la dernière question, je ne vois pas. J'imagine que vous vous trompez : vous ciblez la séquence ADN codant pour l'ARN 18s (qui est présent en plusieurs copies dans la cellule). Si vous ciblez réellement l'ARN, il faut passer par une reverse transcriptase. Ce que n'est pas capable de faire une simple Taq-pol (à ma connaissance), et nécessite donc une enzyme et une étape supplémentaire, qui est de transformer les ARN (ici, s) en ADN complémentaire.
    微生物

  4. #3
    rajh

    Re : (licence/master) Question sur la pcr pour un rapport de stage, merci

    Bonjour,
    Merci pou la réponse,
    en effet je me suis trompé, c'est pas RLFT mais bien RLFP. Merci pour les informations complémentaires. J'ai pas eu de cours spécialisé pour les techniques de biochimie.
    Oui, vous avez raison, je me suis complètement trompé. J'ai relus bien les articles et fait des recherches en plus sur internet. Il y a aucune présence de reverse transcriptase. Et on cible bien le gène codant pour l'ARN 18s et non directement ARN 18s.

    Encore merci, pour les informations.
    Donc la PCR multiplex est la méthode la plus pratique pour une prévalence ?


  5. #4
    biseibutsu

    Re : (licence/master) Question sur la pcr pour un rapport de stage, merci

    La plus pratique et la plus utilisée. Généralement, une ou deux personnes développent LE protocole optimal utile pour le labo, puis pas touche! Et cela fonctionne généralement très bien
    微生物

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