Effet Leptomycine B pas détecté

[invite8812f36a]

Bonjour à tous,
Je vous écris car j'ai un soucis que je n'arrive pas à expliquer...
J'ai des constructions avec lesquels j'exprime des protéines bactériennes taggées dans les HeLa.
Quand je regarde en IF, après traitement à la leptomycine B (blocage de l'export nucléaire via CRM1), je vois que mes prot sont enrichies dans le noyau.

Par contre, après que je réalise un fractionnement cellulaire où je sépare noyau de cytoplasme, je ne vois pas une augmentation de signal en western même dans les cas où j'avais un grand effet en IF.

Attention, le fractionnement à été réalisé dans des conditions où je respecte les volumes réels de la cellule. Disant, si j'ai 10 cellules, j'aurais le volume correspondant dans 10 cytosols et à 10 noyaux ré suspendus dans le même volume final. Mais même entre deux fractions nucléaires je n'observe aucun effet.
Il faut aussi tenir en compte que tous mes controls internes de fractionnement sont bons.

Ps: avez vous une protéine nucléaire qui serait retenu dans le noyau après traitement me conseiller pour un Western?

Merci d'avance pour votre aide précieuse!
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[noir_ecaille]

À propos des HeLa et de CMR1 :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC24519/

HeLa cell cytosol treated with N-ethylmaleimide (NEM) or phenyl-Sepharose to inactivate or deplete Crm1, respectively, is still fully active in the PKI export assay. Significantly, the export activity can be depleted from cytosol by preadsorption with a protein conjugate that contains a functional NES. These data indicate that cytosol contains an export activity that is distinct from Crm1 and is likely to correspond to an NES receptor.

Bien sûr ça n'explique pas tout dans vos résultats -- comme l'observation IF d'un visible enrichissement du noyau.

Concernant des protéines retenues dans le noyau après action de la leptomycin B :
http://www.invivogen.com/leptomycin-b

It has been demonstrated that Leptomycin B can cause the nuclear accumulation of proteins that shuttle between the cytosol and nucleus such as IRAK-1and NLRC5

Par contre ce serait une bonne idée de développer (beaucoup) plus votre protocole. Ça peut aider à trouver d'où vient votre souci d'enrichissement.

[noir_ecaille]

Et au passage, quel est le but de l'étude ?

[invite8812f36a]

Merci de vos réponses.
J'étais bien au courant de l'existence d'autres exportines dans le noyau mais comme vous avez indiqué, cela n'explique pas mon enrichissement dans le noyau lors de l'IF. ça se trouve la lepto n'as juste pas marché, je vais tester aujourd'hui sur une protéine à export CRM1.

Alors, pour le développement du sujet, j'ai transfecté des HeLa (80-100% de confluence) de confluence dans des puits d'une plaque de 20 (où au fond de la plaque j'avais mis la lamelle pour l'IF donc c'est les mêmes cellules que j'allais fractionner). 4h après la transfection, le milieu à été renouvelé et 8h après, dans les puits à traiter j'ai mis du milieu contenant 2ng/mL de leptomycin B. Rien de extraordinaire.
Le lendemain matin, la lamelle a été récupéré pour réaliser l'IF (protocole classique, 20m de fixation PFA, 4m de permeabilisation au Triton et 1h de chaque Ac (primaire Anti FLAG (tag des prot) et secondaire couplé Alexa488) et Hoescht).

C'est vrai qu'un traitement "overnight" à la leptomycine B peut effectivement tuer les cellules. Pour l'IF j'ai lavé les lamelles quand même avant de fixer pour m'en débarrasser des cellules mortes. Après, est ce que le fait de fixer les cellules au PFA fait que les protéines aient dans le noyau? J'ai aucune idée...

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite8812f36a]

Le but c'est d'étudier les effects des protéines à interaction avec l'hôte

[noir_ecaille]

Et votre Western il a quel tête ?