Pyroséquençage

[invited337b73e]

Bonjour!

Dans le pyroséquençage, on utilise de l'APS et une sulfurylase.
La sulfurylase permet de produire de l'AMP à partir de l'APS.
Cet AMP formera avec le PPi (formé lors de l'intégration d'un nucléotide par l'ADN polymérase) de l'ATP.

1) Pourquoi on utilise une sulfurylase et de l'APS? On peut pas bêtement mettre de l'AMP pour générer de l'ATP (AMP + PPi --> ATP)?
2) concrètement, quand on dit qu'on fait passer les nucléotides un par un ca signifie quoi? J'ai une machine qui va tester les 4 nucléotides un par un et qui "note" la détection de lumière pour tel nucléotide?

Merci beaucoup
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[Syst.]

Bonjour,

1) C'est parce que la sulfurylase (ou ATP sulfurase) accélère seulement la réaction SO₄^2- + ATP <—> APS + PPi (dans les deux sens, comme tout enzyme il me semble) Elle n'a aucune influence sur AMP + PPi <—> ATP (très très fortement déplacé vers la formation de AMP + PPi)

2) Je ne sais pas.

[invited337b73e]

Merci beaucoup

[invite3b5f5a07]

Salut

2) Oui, ça doit être quelque chose comme ça. Chaque nucléotide est testé l'un après l'autre. Ils sont dégradés par l'apyrase en parallèle de la réaction avec la sulfurylase. Je ne connais pas le fonctionnement précis d'une machine utilisant le pyroséquençage, mais il peut se faire via synthèse en phase solide. Aucne idée si cette technique est activement utilisée de nos jours.

Gordak

[A voir en vidéo sur Futura]

[invited337b73e]

Merci!! (10 caractères pfff)

[invitebf19fa4c]

De ce que j'ai compris en relisant mes vieux cours de PACES :
2) Les nucléotides sont ajoutés un à un, et si le nucléotide ajouté correspond à celui que doit incorporer la polymérase (25% de chance), alors celui-ci devient un nucléoside (qui sera incorporé) et libérera un pyrophosphate (etc. jusqu'à donner de l'oxyluciférine, donnant un signal lumineux)
Si le nucléotide ajouté ne correspond pas, il sera, comme l'a dit Gordak, dégradé par une apyrase.

Aucne idée si cette technique est activement utilisée de nos jours.

Je crois que c'est la technique la plus utilisé (dites moi si je me trompe, je n'en suis pas sûr), car plus rentable que la méthode de Sanger.
Mais il existe aussi la méthode de Maxam et Gilbert, que je ne connais absolument pas.

D'ailleurs, si ce n'est pas hors topic, j'ai beaucoup de mal à comprendre cette méthode, quelqu'un aurait un lien clair pour la comprendre ? (Si la question n'a pas sa place ici, j'irai créer un autre topic)