Question aux professionnels de l'IHC !!

[invite4ae3ed6a]

Bonjour à tous,
J'ai une petite question à poser aux professionnels de l'immunohistochimie (IHC): je viens d'en faire une complètement ratée où je n'ai vu que mes noyaux se colorer en bleu (hématoxyline), pas de trace de l'Ag que je recherche [Pour explication, le tissu est le pancréas, Ac est anti-insuline, l'animal est la souris], j'ai suspecté alors deux points:
- Ac utilisé est trop dilué au point de ne rien voir du tout (dilution utilisée= 1/4000)
- Le kit de détection: il y a 4 produits: A, B, C et D il faut mélanger à la dernière minute le C et le D, et en faite l'aspect du C m'a paru suspect, je m'explique:
dans l'eppendorff il y a avait un petit culot, comme une précipitation, j'ai vortexé mais après l'ajout du c+d, là où d'habitude je vois le tissu se colorer en marron, là je n'ai rien vu !! je me suis dit, c'est peut être le c qui n'est pas bon vu qu'il y avait un précipitat !!!!


Merci de votre aide !!!
Amicalement,
cysto
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[invite4ae3ed6a]

IHC refaite, résultats des courses : le tissu se décolle juste après 2h d'incubation avec l'Ac primaire (cette fois ci je suis même pas arrivée au c+d) !!!

Aidez moi svp, je suis face à un vrai dilemme !! Dois je redilué l'Ac ?? faire une incub à 1h ??

[noir_ecaille]

C'est quel nom pour le kit ? Ça aiderait à trouver des infos mais surtout d'autres utilisateurs.

Le mettre dans le titre serait même une bonne idée.

[invite4ae3ed6a]

c'est DAB peroxydase !!

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite02e16773]

Désolé je reposte, mauvaise manip

Les infos que tu donnes sont très vagues, ça pourrait venir de n'importe quelle étape...

Est-ce que ton protocole est au point ? Est-ce que tu l'as déjà fait marcher ?
Est-ce que d'autres gens du labo l'ont fait marché ?

Est-ce que ton anticorps marche avec ce protocole ?
Si non, il faut faire des tests avec différentes dilutions.

Comment tu gardes tes anticorps ?
Un anticorps trop souvent congelé / décongelé, ou gardé trop longtemps à 4°C ne fonctionne plus.

[invite4ae3ed6a]

En fait, ce qui me dérange vraiment quand j'ai refait ma manip c'est que tous mes tissus se décollaient des lames !! lames avec lesquelles j'ai fait d'excellentes H&E !! je suis vraiment perplexe !!
Le protocole de l'IHC a été mis au point et réussi auparavant !! ce que j'ai changé c'est juste l'Ac et le H2O2 et j'ai remarqué que le décollement se faisait après l'incubation de 1h juste près le lavage dans le pbs !!!
ça peut être le PBS ?? je l'ai préparé le 15-05-2014 !!?? et conservé à 4° !!!

D'où vient ce décollement que j'ai pas vu avec la HE ?? est ce que le PBS peut être impliqué ?? H2O2 ?? l'Ac ????


bien cordialement,
cysto !!

[invite513ac0a6]

Ca peut dépendre de ton protocole de préparation des tissus avant la coupe, et aussi du type de lames que t'utilises. On manque toujours d'infos pour te dire ce qui peut avoir foiré.

Quand tu dis que tu as changé l'Ac, ce n'est plus la même référence du tout ou c'est juste un nouveau lot? Il va falloir que tu sois précis car chaque détail compte

[invite4ae3ed6a]

Lames superfrost, utilisées et réutilisées (donc recyclées mais bien sûr dégraissées dans de l'alcool 70 + hcl)
Ac changé = nouveau stock mais toujours anti ins de même origine, même dilution !!

Moi perso, j'ai suspecté : PBS, Ac, H2o2 est ce que ça peut être l'un des trois !! ou peut être les lames ??? mais mon tissu se décolle après 1h d'incub avec l'Ac !! ou alors c'est le BSA !!


ça me rend dingue car je gaspille mon matos et c'est très précieux !!!

[invite46feecda]

Bonjour,
Si les prélèvements se décollent, ça doit venir de la qualité des lames que tu utilises. Je te recommande les lames silanisées ou chargées positivement.
Le décollement peut aussi venir des coupes histologiques trop épaisses, sinon le traitement dans le bain marie, quand tu sors tes lames, laisse les à température ambiante quelques secondes avant de les plonger dans ta solution de lavage pour éviter un choc thermique.
Protège tes lames de la lumière quand tu travailles avec la peroxydase.
J'espère que ça va marcher, ne te décourage pas

[invite02e16773]

J'ai jamais fait d'immuno directement sur lames ...
Mais dans les labos d'à côté ils font ça, sur des superfrost avec des coupes cryostat et ça marche très bien.

Ne gaspille pas ton matériel.
Utilises des controles pour faire des essais et trouver les conditions qui font que ça se décolera pas.

[invite4ae3ed6a]

Ce qui me rend complétement hébétée c'est le fait que la H&E ait très bien fonctionné !! les coupes ne sont pas épaisses sinon je l'aurais remarqué sur la H&E !!
Mes lames sont dans une boite qui se trouve dans un placard donc parfaitement à l'abri de la lumière !!...quoi d'autres : vous suspecter la phase du déparaffinage, voilà comment j'ai procédé : dès que j'ai confectionné mes rubans avec le microtome je les ai étalé sur mes lames (recyclées) avec une goutte d'albumine, mis dans l'étude à 40° pendant quelques heures puis dans l'étuve à 37° overnight !! encore une fois, avec la H&E ça ne s'est pas décollé !!!

???

[Flyingbike]

Le HE est une coloration chimique, beaucoup plus simple que de l'IHC et qui marche vraiment tout le temps (pour peu que vous ayez un tissu sur la lame).

Comme le dit Guillaume, il y a de très nombreux paramètres à essayer avant de conclure.

[invite4ae3ed6a]

Bonjour,
Dernière question svp si je puis me permettre: est ce que le fait de laisser les lames (juste après les avoir couper) toute une nuit dans une étuve à 37° peut abîmer le tissu au point de le faire décoller de la lame !!

Bien cordialement,
cysto