Répondre à la discussion
Affichage des résultats 1 à 13 sur 13

Question aux professionnels de l'IHC !!



  1. #1
    cysto

    Question aux professionnels de l'IHC !!

    Bonjour à tous,
    J'ai une petite question à poser aux professionnels de l'immunohistochimie (IHC): je viens d'en faire une complètement ratée où je n'ai vu que mes noyaux se colorer en bleu (hématoxyline), pas de trace de l'Ag que je recherche [Pour explication, le tissu est le pancréas, Ac est anti-insuline, l'animal est la souris], j'ai suspecté alors deux points:
    - Ac utilisé est trop dilué au point de ne rien voir du tout (dilution utilisée= 1/4000)
    - Le kit de détection: il y a 4 produits: A, B, C et D il faut mélanger à la dernière minute le C et le D, et en faite l'aspect du C m'a paru suspect, je m'explique:
    dans l'eppendorff il y a avait un petit culot, comme une précipitation, j'ai vortexé mais après l'ajout du c+d, là où d'habitude je vois le tissu se colorer en marron, là je n'ai rien vu !! je me suis dit, c'est peut être le c qui n'est pas bon vu qu'il y avait un précipitat !!!!


    Merci de votre aide !!!
    Amicalement,
    cysto

    -----

    Dernière modification par cysto ; 14/10/2014 à 20h12. Motif: Faute d'orthographe !!
    Carpe diem...

  2. Publicité
  3. #2
    cysto

    Re : Question aux professionnels de l'IHC !!

    IHC refaite, résultats des courses : le tissu se décolle juste après 2h d'incubation avec l'Ac primaire (cette fois ci je suis même pas arrivée au c+d) !!!

    Aidez moi svp, je suis face à un vrai dilemme !! Dois je redilué l'Ac ?? faire une incub à 1h ??
    Carpe diem...

  4. #3
    noir_ecaille

    Re : Question aux professionnels de l'IHC !!

    C'est quel nom pour le kit ? Ça aiderait à trouver des infos mais surtout d'autres utilisateurs.

    Le mettre dans le titre serait même une bonne idée.
    "Deviens ce que tu es", Friedrich W. Nietzsche

  5. #4
    cysto

    Re : Question aux professionnels de l'IHC !!

    c'est DAB peroxydase !!
    Carpe diem...

  6. #5
    Guillaume69

    Re : Question aux professionnels de l'IHC !!

    Désolé je reposte, mauvaise manip

    Les infos que tu donnes sont très vagues, ça pourrait venir de n'importe quelle étape...

    Est-ce que ton protocole est au point ? Est-ce que tu l'as déjà fait marcher ?
    Est-ce que d'autres gens du labo l'ont fait marché ?

    Est-ce que ton anticorps marche avec ce protocole ?
    Si non, il faut faire des tests avec différentes dilutions.

    Comment tu gardes tes anticorps ?
    Un anticorps trop souvent congelé / décongelé, ou gardé trop longtemps à 4°C ne fonctionne plus.

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    cysto

    Re : Question aux professionnels de l'IHC !!

    En fait, ce qui me dérange vraiment quand j'ai refait ma manip c'est que tous mes tissus se décollaient des lames !! lames avec lesquelles j'ai fait d'excellentes H&E !! je suis vraiment perplexe !!
    Le protocole de l'IHC a été mis au point et réussi auparavant !! ce que j'ai changé c'est juste l'Ac et le H2O2 et j'ai remarqué que le décollement se faisait après l'incubation de 1h juste près le lavage dans le pbs !!!
    ça peut être le PBS ?? je l'ai préparé le 15-05-2014 !!?? et conservé à 4° !!!

    D'où vient ce décollement que j'ai pas vu avec la HE ?? est ce que le PBS peut être impliqué ?? H2O2 ?? l'Ac ????


    bien cordialement,
    cysto !!
    Carpe diem...

  9. Publicité
  10. #7
    random_postdoc

    Re : Question aux professionnels de l'IHC !!

    Ca peut dépendre de ton protocole de préparation des tissus avant la coupe, et aussi du type de lames que t'utilises. On manque toujours d'infos pour te dire ce qui peut avoir foiré.

    Quand tu dis que tu as changé l'Ac, ce n'est plus la même référence du tout ou c'est juste un nouveau lot? Il va falloir que tu sois précis car chaque détail compte

  11. #8
    cysto

    Re : Question aux professionnels de l'IHC !!

    Lames superfrost, utilisées et réutilisées (donc recyclées mais bien sûr dégraissées dans de l'alcool 70 + hcl)
    Ac changé = nouveau stock mais toujours anti ins de même origine, même dilution !!

    Moi perso, j'ai suspecté : PBS, Ac, H2o2 est ce que ça peut être l'un des trois !! ou peut être les lames ??? mais mon tissu se décolle après 1h d'incub avec l'Ac !! ou alors c'est le BSA !!


    ça me rend dingue car je gaspille mon matos et c'est très précieux !!!
    Carpe diem...

  12. #9
    nawelbio

    Re : Question aux professionnels de l'IHC !!

    Bonjour,
    Si les prélèvements se décollent, ça doit venir de la qualité des lames que tu utilises. Je te recommande les lames silanisées ou chargées positivement.
    Le décollement peut aussi venir des coupes histologiques trop épaisses, sinon le traitement dans le bain marie, quand tu sors tes lames, laisse les à température ambiante quelques secondes avant de les plonger dans ta solution de lavage pour éviter un choc thermique.
    Protège tes lames de la lumière quand tu travailles avec la peroxydase.
    J'espère que ça va marcher, ne te décourage pas

  13. #10
    Guillaume69

    Re : Question aux professionnels de l'IHC !!

    J'ai jamais fait d'immuno directement sur lames ...
    Mais dans les labos d'à côté ils font ça, sur des superfrost avec des coupes cryostat et ça marche très bien.

    Ne gaspille pas ton matériel.
    Utilises des controles pour faire des essais et trouver les conditions qui font que ça se décolera pas.

  14. #11
    cysto

    Re : Question aux professionnels de l'IHC !!

    Ce qui me rend complétement hébétée c'est le fait que la H&E ait très bien fonctionné !! les coupes ne sont pas épaisses sinon je l'aurais remarqué sur la H&E !!
    Mes lames sont dans une boite qui se trouve dans un placard donc parfaitement à l'abri de la lumière !!...quoi d'autres : vous suspecter la phase du déparaffinage, voilà comment j'ai procédé : dès que j'ai confectionné mes rubans avec le microtome je les ai étalé sur mes lames (recyclées) avec une goutte d'albumine, mis dans l'étude à 40° pendant quelques heures puis dans l'étuve à 37° overnight !! encore une fois, avec la H&E ça ne s'est pas décollé !!!

    ???
    Carpe diem...

  15. #12
    Flyingbike

    Re : Question aux professionnels de l'IHC !!

    Le HE est une coloration chimique, beaucoup plus simple que de l'IHC et qui marche vraiment tout le temps (pour peu que vous ayez un tissu sur la lame).

    Comme le dit Guillaume, il y a de très nombreux paramètres à essayer avant de conclure.

  16. Publicité
  17. #13
    cysto

    Re : Question aux professionnels de l'IHC !!

    Bonjour,
    Dernière question svp si je puis me permettre: est ce que le fait de laisser les lames (juste après les avoir couper) toute une nuit dans une étuve à 37° peut abîmer le tissu au point de le faire décoller de la lame !!

    Bien cordialement,
    cysto
    Dernière modification par cysto ; 22/10/2014 à 12h14.
    Carpe diem...

Sur le même thème :

Discussions similaires

  1. interviewer des professionnels de l'environnement
    Par AgnesBordeaux dans le forum Environnement, développement durable et écologie
    Réponses: 0
    Dernier message: 17/03/2013, 09h56
  2. Professionnels chimie
    Par pirouette60 dans le forum Orientation après le BAC
    Réponses: 0
    Dernier message: 05/04/2012, 21h19
  3. Pour les professionnels de la maintenance
    Par cabs dans le forum Matériel - Hardware
    Réponses: 1
    Dernier message: 28/11/2009, 19h07
  4. professionnels de l'isolation extérieure
    Par alexos dans le forum Habitat bioclimatique, isolation et chauffage
    Réponses: 1
    Dernier message: 01/08/2009, 08h53