rDNA ou rRNA?

[inviteec955545]

Bonjour,
je souhaite etudier la flore bacterienne presente dans un ver parasite, pour cela j'ai donc des amorces universelles pour les 16S des bacteries qui me permettront d'arriver a mes fins.
La question reste pour le debut du protocole : il en existe certains (de protocoles) ou l'on fait l'extraction d'ARN, puis RT-PCR avec les amorces universelles, et d'autres ou on fait l'extraction d'ADN et PCR classique.

Je sais que la question est plutot specifique, mais sait-on jamais, peut etre avez vous entendu parler ou avez vous des idees sur les avantages et inconvenients de tel ou tel protocole... ?

Merci d'avance
CARO
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[invitec9f0f895]

SAlut

L'amplification a partir du rDNA me semble avoir plus d'avantage qu'a partir du rRNA. L'ADN est plus stable, moins degradés, ensuite il n'y a pas de RT necessaire, une etape en moins, sans parler de l'extraction d'ADN qui est souvent plus facile a faire.
l'avantage que je verrais a travailler avec le rRNA est qu'alors tu ne travailles qu'avec les ARN transcrits. Le rDNA etant souvant dupliqué dans les génomes, il est possible que toutes les unités de rDNA ne soient pas actives transcriptionnellement.

YOyo

[invite4c320a31]

Salut!

D'accord avec Yoyo... mieux vaut le faire sur le rDNA... C'ets quand même plus simple. Pour le nombre d'unitées rDNA actives, il est clair qu'ils ne sont pas tous actis, mais peu importe dans tin cas... surtout pour une bactérie et les inactifs en pleine expansion sont peu nombreux...

[inviteec955545]

Yop je suis d'accord avec vous, le rDNA est beaucoup plus simple d'utilisation ! Mais pourquoi des gens le font donc avec le rRNA? Quelle est donc cet avantage cache?
Si l'on veut etudier l'activite, ok, mais si c'est juste pour une determination de type (profiling) ! Je ne comprends pas l'interet... alors qu'il doit bien y en avoir un puisque des protocoles le conseillent !

Que les rDNA soient tous actifs ou non, on s'en fiche un peu pour ca... je ne comprends vraiment pas...

CARO

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteb361f36f]

Bonjour les spécialistes,

Je n'ai jamais minip d'acides nucléiques mais vos activités me passionnent.
Alors pour être sûr de bien suivre j'aimerais qq info de base !!!
rARN est bien l'ARN ribosomial, avec ses deux portions 16 et 23 swidberg !
rADN serait l'ensemble des séquences ADN qui transcrivent l'rARN ?
Comment dans ce cas l'isoler pour l'extraire et l'identifier ?

Autre domaine celui de la phyllogénie de Lecointre, il a souvent comparé les séquences nucléotidiques des portion 16s des espèces voisines, mais c'était sur les séquences de l'ARN directement ou celles de l'ADN qui est à l'origine de cet ARN 16s ?

Grand merci de votre sollicitude

[inviteec955545]

Chalut hexapat,
rRNA c'est effectivement bien l'ARN ribosomique. Chez les eucaryotes (cellules a noyau) il y a 4 portions, 18S qui forme la petite sous-unite du ribosome, 28S, 5.8S et 5S qui forment la grande. Les 18S, 28S et 5.8S sont codes par l'ADN ribosomique, ou rDNA, sous forme d'un grand et unique super-ARN preribosomique (de 45S) qui sera clive pour donner les 3 types d'ARN.
En fait la transcription de cet ADNr est speciale, parce que deja il est repete en tandem, cad qu'il y a un nombre particulierement eleve de repetitions de la sequence qui est transcrite en ARNr. Et cette transcription se fait a grande vitesse, donc il y a plusieurs ARN polymerases (les enzymes ki fabriquent l'ARN a partir de l'ADN) qui transcrivent en meme temps sur l'ADN. Ce qui donne au final ces fameuses structures en feuille, de la synthese des ARNr.
http://ocw.mit.edu/OcwWeb/Biology/7-...04/CourseHome/

Les 5S sont transcrits a part dans le nucleole, par une autre polymerase meme (la RNA pol III, alors que les autres sont transcrits par la pol I)

Chez les procaryotes, il n'y a qu'une seul pol, la pol I, et les sous unites des ribosomes sont 5S, 16S et 23S. On se sert des 16S pour le profiling des bacterie puisque chaque 16S est specifique d'une espece. Les arbres phylogenetiques bacteriens sont, pour les plus fiables, bases sur une phylogenie 16S.

Voili voilo
++
CARO

[inviteec955545]

Arrgh j'ai perdu la suite de mon message !! :'(

Donc je disais que lors des phylogenies, on peut aussi bien utiliser l'ARNr que l'ADNr, puisque l'ARN qui est synthesise ne subit que peu de modifications et est donc presque identique a l'ADNr. L'analyse de l'un ou de l'autre est donc similaire, mais il est tjrs plus difficile de travailler avec des ARN qu'avec des ADN, donc ce genre de phylogenie est realisee la plupart du temps a partir des ADNr. D'ou ma question, "pourquoi certains auteurs preferent s'emm... a travailler avec l'ARNr ?"

Sinon pour l'extraction, par exemple pour un profiling de bacteries, lorsque tu veux determiner quelles especes sont presentes a tel endroit, en fait tu extrais l'ADN total de tes bacteries, et apres tu fais une PCR (amplification de l'ADN) avec des amorces universelles des 16S des bacteries. C'est qu'il existe sur les ARN 16S des sequences communes a toutes les bacteries. Entre 2 sequences communes, il y aura une specifite, et chaque espece de bacterie pourra etre identifiee grace a ces sequences entre les sequences communes, par sequencage de l'amplifiat PCR.

Voili
Si des choses ne te paraissent pas tres claires, just ask !

CARO bis

[inviteb361f36f]

Sôlu CARO,

Super Formid' ton exposé, on sent que tu baignes, sorry de ne pas t'aider à répondre à ta question très manip' !
Ne me pousse pas à abuser de questions !
Par ex : avec leur faculté de se transmettre des fragments d'ADN par conjuguaison, comment les bactéries gardent-elles leurs critères d'espèce ?
Et quand on fait la classique extraction d'ADN à partir de cellules vgales broyées, dans l'ethanol, l'amas floconeux plusoumoins "chevelu" c'est un mélange n'est-ce pas ?
ET ( ça y est jabuzzzz ! ) Le vocabulaire " chromosome " n'est-il pas exagèré pour l'ADN circulaire des bactéries ? oim, je réservais ça à l'ADN "habillé" de ses protéines associées (donc eucaryotes ) !!!
Encore big merci !

[inviteb361f36f]

Encore une bafouille, si j'ai bien suivi en disant qu'ADNr et ARNr son à peu près équivalents tu sous-entends qu'il n'y a pas ou peu d'intron dans ces séquences rADN ?

[inviteec955545]

Abuzz des questions, c'est ce qu'il y a de mieux pour tout le monde !!

Alors concernant les conjugaisons chez les bacteries, eh bien c'est justement un gros probleme pour les criteres d'especes.
Deja les genes qui sont transmis et gardes ne sont pas des genes "essentiels", puisque les bacteries les ont deja et que cela leur suffit. Donc il n'y aura pas de transfert d'ADNr par exemple, et c'est aussi pour cela que la phylogenie construite a partir de cette portion d'ADN est relativement fiable.
Les genes conjugues sont souvent des genes qui vont conferer un avantage adaptatif, au bon endroit au bon moment. Mais pas toujours.
Et c'est pourquoi, dans les arbres phylogenetiques faits a partir de genes X ou Y (il n'y a pas que le 16S dans la vie !), desfois on retrouve des aberrations, une bacterie d'un groupe completement a part qui va se retrouver jointe avec une autre dont on sait qu'elle n'est absolument pas proche, etc. Lorsque dans un arbre on a des choses qui clochent, la premiere question que l'on se pose, c'est "transfert de gene??". Il ne faut jamais faire un arbre a partir d'un seul gene..

Pour la classique extraction, l'amas floconneux est bien un melange des ADN totaux. D'ailleurs c'est marrant les extractions "fait maison", avec que des produits que l'on trouve chez Mr tout le monde. Pour la fete de la science il y avait pas mal d'endroit ou ils faisaient ca.

Pour l'appellation de chromosome pour l'ADN circulaire des bacteries, deja il y a deux choses : tu parles de leurs petits plasmides ou de leur ADN genomique? Parce que leur ADN genomique, circulaire ou non, est toujours habille de proteines !! Aussi procaryote qu'il soit! Enfin... tu me mets un doute la, je vais aller voir certaines choses!! Pour les plasmides en revanche, on ne parle pas de chromosome, juste d'ADN plasmidique.

Quant a ta derniere question, c'est exactement ce qu'il fallait comprendre

+++
CARO

[invitee8b3f97e]

Salut !

Le typage classique d'un écosystème bactérien se fait bien en utilisant l'ADN pour une PCR 16S classique. Il me semble que l'utilisation du rRNA est un moyen de dénombrement des bactéries.

En gros, si tu as une ou 10^9 cellules d'un certain type, tu n'obtiendras qu'un seul profil en amplifiant l'ADN. Par contre en travaillant à partir d'ARN (proportionnel au nombre de cellules en activité) et en combinant celà avec un système de quantification de l'amplification (voir le mot clé : PCR quantitative), tu peux estimer la population bactérienne présente.

Sinon petites questions pour mon info personnelle :
- vas tu combiner ton amplification de l'ADN 16S avec une autre méthode (RFLP, TTGE, séquencage, autre ?)
- aurais tu une référence (articles) des amorces utilisées ?

[inviteec955545]

Yep sur la plupart des papiers que j'ai vu, c'etait bien en utilisant l'ADNr. Mais quelques irreductibles utilisent l'ARNr, juste pour le typage, va comprendre pourquoi...
Comme tu dis, l'ARNr est utilise pour les determinations de l'activite des bacteries, les proportions de telle ou telle population.

Pour repondre a tes questions :
- je fais apres ma PCR un profiling par DGGE/TTGE (Denaturating Gradient Gel Electrophoresis/Temporal Temperature Gradient gel Electrophoresis).
C'est un gel qui se base sur les proprietes uniques de migration des frangments 16S amplifies, dans un gel denaturant.
Je pense que je ferai ensuite du sequencage, selon les resultats du DGGE.

- je n'ai pas de reference d'amorce, mais j'ai les sequences si ca t'interesse.

CARO

[invitee8b3f97e]

Salut et merci pour tes réponses.

Je veux bien en effet les séquences des amorces (en message privé peut être pour ne pas encombrer inutilement le forum). Par contre c'est étonnant que tu n'ais pas de références.Elles sont peut être propres à ton labo ?

[inviteec955545]

En fait c'est un mec d'un autre labo qui les a transmis a ma maitre de stage qui me les a transmis, c'est pour cela que je n'ai pas de ref. Par contre, vu que ce sont des primers bien connus, ils ont des noms specifiques, tu peux peut etre retrouver des choses a partir de ca.
Je mets sur le forum, ca peut tjrs interesser X ou Y !

Alors le sens c'est U968-GCF (CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC)
Et l'anti sens c'est L1401-r (GCG TGT GTA CAA GAC CC)

Vais chercher la longueur qu'il amplifie...

CARO