Bonjour,
J'aimerai savoir si la Tm entre 2 amorces pour faire de la PCR était important, en effet je travail sur la vérification que mon gène a bien été remplacé par recombinaison homologue. Donc je vérifie la taille des fragments. Mais je n'ai aucun résultats (pas de bandes) pour le 7ème échantillon. Les Tm sont de 62°C et de 44,1°C, je me demandais si cela pouvait être l'un des causes.
Merci de votre aide.
Cordialement,
JoKe_CiTy
C'est possible en effet, vu qu'en général on essaye d'avoir des Tm proches. Ce qu'on peut dire en tout cas c'est que tu n'es clairement pas dans les meilleures conditions.
YOyo
Oui, mais j'ai créé les amorces et j'ai vérifié qu'il n'y est pas plusieurs sites possibles. Après j'aimerai savoir quels effets ça pourrait avoir et comment cela se produit.
Cordialement,
JoKe_CiTy
Ben vu tes Tm il faut faire une hybridation à basse température (on conseille en générale 5°C en dessous du Tm théorique). Mais a 40°C ton oligo de Tm 60° va s'hybrider spécifiquement n'importe ou!
Tu pourrais rajouter quelques bases à l'oligo de Tm 44°C pour augmenter sa stabilité.
Yoyo
"Non spécifiquement" plutôt?Envoyé par Yoyo
Je rejoins Yoyo, tu peux rajouter 3/4 bases à ton oligo 44° pour arriver autour de 60°C de Tm. En général, un écart de plus de 5°C entre les Tm de deux amorces, il y a un gros risque que d'avoir soit rien, soit de l'amplification non spécifique.
Il existe des programmes comme Primer3 qui permettent de trouver des bons couples d'amorces sur une séquence donnée.
Oui tout a fait!
Yoyo
Je suis actuellement entrain d'essayer avec une température d'hybridation de 48°C en espérant voir une bande. Si par tout hasard, j'en vois plusieurs, j'essayerai d'augmenter la température de 2°C.
Cordialement,
JoKe_CiTy
Le problème c'est que plus du augmente la température d'hybridation, moins ton amorce "44°C" va s'hybrider, voir plus du tout. Je pense qu'il faut que tu la refasse, voir refaire tout le couple pour avoir deux Tm proches.
Oui en effet, avant j'utilisais une température d'hybridation de 54°C mais j'ai baissé à 48°C pour voir si il y avait un changement. Et même après cette baisse de température je n'observe toujours rien sur le gel. Je vais donc refaire le couple en espérant que cette fois-ci, ça fonctionne;
Cordialement,
JoKe_CiTy
Tiens: http://bioinfo.ut.ee/primer3/
C'est très complet, plein d'options modifiables et franchement très efficace.
Merci !
J'ai commander de nouvelles amorces mais c'est vrai que ton site semble complet
Cordialement,
JoKe_CiTy
