Questions "Générales" en Culture Cellulaire Eucaryotes

[inviteffc2b2e2]

Bonjour.

Cela fait quelques temps que je parcours ce forum (sans y être inscrite) et je ne trouve pas de réponses à mes questions (je cherche peut être mal). Du coup, j'ai sauté le pas, je me suis inscrite aujourd'hui ! Et j'arrive avec mon lot d'interrogations concernant la culture de cellules eucaryotes.

-Lors d'une culture, il est nécessaire de changer le milieu (contenant du rouge phénol) lorsque celui-ci vire au jaune. Jusque là, pas de souci. Mais que faire lorsque l'on ne constate pas de changement de couleur du milieu, même après 1 semaine d'incubation avec des cellules (dans mon cas : des hybridomes) en développement ? D'où peut provenir cet absence de jaunissement ? (J'ai vérifié, mon milieu contient bien du rouge phénol et lorsque j'ajoute de l'acide, celui ci vire bien au jaune).

-Est-il possible de séparer les cellules vivantes des cellules mortes d'une culture sans cytométrie de flux (ou autre appareil couteux) ni gradient ? Genre par une simple centrifugation à X rpm pendant X minutes ?

Merci par avance pour les réponses que vous pourrez fournir à mes questions.
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[invitec9f0f895]

Bonjour.

Cela fait quelques temps que je parcours ce forum (sans y être inscrite) et je ne trouve pas de réponses à mes questions (je cherche peut être mal). Du coup, j'ai sauté le pas, je me suis inscrite aujourd'hui ! Et j'arrive avec mon lot d'interrogations concernant la culture de cellules eucaryotes.

bienvenue à toi!

-Lors d'une culture, il est nécessaire de changer le milieu (contenant du rouge phénol) lorsque celui-ci vire au jaune. Jusque là, pas de souci. Mais que faire lorsque l'on ne constate pas de changement de couleur du milieu, même après 1 semaine d'incubation avec des cellules (dans mon cas : des hybridomes) en développement ? D'où peut provenir cet absence de jaunissement ? (J'ai vérifié, mon milieu contient bien du rouge phénol et lorsque j'ajoute de l'acide, celui ci vire bien au jaune).

Le mieux est quand meme de regarder tes cellules au microscopes pour voir leur confluence. L'indicateur coloré n'est qu'un indicateur de pH, qui est plus ou moins corrélé avec la croissance cellulaire. Comme tout produit biologique, le milieux va "vieillir" surtout à 37°. Donc le remplacer régulièrement est un gage d'avoir toujours ce qu'il faut pour la croissance de tes cellules.

-Est-il possible de séparer les cellules vivantes des cellules mortes d'une culture sans cytométrie de flux (ou autre appareil couteux) ni gradient ? Genre par une simple centrifugation à X rpm pendant X minutes ?

Merci par avance pour les réponses que vous pourrez fournir à mes questions.

Il existe des colorants (genre WST1) qui permettent de ne marquer que les cellules vivantes ce qui s'observe par spectrophotometre.

YOyo

[TanguyE]

-Lors d'une culture, il est nécessaire de changer le milieu (contenant du rouge phénol) lorsque celui-ci vire au jaune. Jusque là, pas de souci. Mais que faire lorsque l'on ne constate pas de changement de couleur du milieu, même après 1 semaine d'incubation avec des cellules (dans mon cas : des hybridomes) en développement ? D'où peut provenir cet absence de jaunissement ? (J'ai vérifié, mon milieu contient bien du rouge phénol et lorsque j'ajoute de l'acide, celui ci vire bien au jaune).

Le mieux est quand meme de regarder tes cellules au microscopes pour voir leur confluence. L'indicateur coloré n'est qu'un indicateur de pH, qui est plus ou moins corrélé avec la croissance cellulaire. Comme tout produit biologique, le milieux va "vieillir" surtout à 37°. Donc le remplacer régulièrement est un gage d'avoir toujours ce qu'il faut pour la croissance de tes cellules.

Je rajouterai que certains milieux ne virent au jaune que quand les cellules sont déjà bien amochées et que ce changement n'est pas instantané. La couleur du milieu peut servir d'indicateur, mais c'est pas le plus fiable. De plus, tes cellules risquent de manquer de nutriments essentiels avant que ton milieux change de couleur.
Regarde la fiche de tes cellules sur ATCC (ou ton fournisseur), il devrait y avoir des conseils sur la façon de les cultiver.

-Est-il possible de séparer les cellules vivantes des cellules mortes d'une culture sans cytométrie de flux (ou autre appareil couteux) ni gradient ? Genre par une simple centrifugation à X rpm pendant X minutes ?

La centri basique tu peux oublier, une cellule morte pèse plus ou moins la même chose qu'une cellule vivante. Et pour la coloration que tu suggère Yoyo, elle te permettra de voir le nombre de cellules mortes/vivantes, mais c'est pour les trier que ça va poser problème.

[inviteffc2b2e2]

Merci à vous deux pour vos réponses.

Pour le moment, nous changeons le milieu (IMDM) de nos hybridomes tous les 3 avant qu'il vire de couleur mais comme nous cherchons à récupérer beaucoup d'anticorps, je me demandais si je pouvais laisser un peu plus longtemps (du style 5 jours) sans avoir de gros dégâts...

Pour la séparation des cellules mortes / vivantes, j'ai testé une centrifugation à basse vitesse (300 rpm pendant 4 minutes). Ma collègue me dit que ce matin, les cellules vivantes lui semblent plus nombreuses que les mortes et les débris (ce qui n'était pas le cas hier). A voir si c'est le hasard

[A voir en vidéo sur Futura]

[noir_ecaille]

Bref. Cytométrie de flux = seul tri/sélection possible ?

[inviteffc2b2e2]

Bref. Cytométrie de flux = seul tri/sélection possible ?

Probablement mais pas les moyens pour acquérir un cytomètre de flux