Bonjour !
Je travaille sur de l'ADN assez dégradé et je cherche à amplifier mon ADN extrait sur LightCycler.
Jusqu'à maintenant je travaillais avec 35 cycles et des primers hautement spécifiques. Mais voilà depuis deux semaines la moitié de mes extractions me donnent des Cp de 30 et c'est même le cas pour mon contrôle positif que est dillué au 100e. J'ai essayé avec l'ensemble de mes couples de primers spécifiques et ça me donne plus ou moins le même résultat. J'ai donc essayé d'augmenter mon nombre de cycles à 40 pour voir et là tadaa presque l'ensemble de mes échantillons présentent des Cp inférieures à 30 et mon contrôle positif retombe à une cp de 28. Seul problème mon contrôle négatif : il a dans toutes mes qPCR été positif même en changeant tout (même avec 35 cycles), probablement problème de dimères ou conta par l'air, avec un nombre de cycles de 40 il a une Cp de 30.80. Puis je considérer qu'au dessus de 30 je dois considérer cela comme négatif ?
Merci pour votre aide !
Bonne soirée !!
-----