Bonjour à tous!
j'ai réalisé un western blot, où ma protéine en monomère devait être aux alentours de 35 KDa, mais au fait j'ai eu d'autres bandes qui sont à peu près au double et triple du poids présumé! du coup j'ai fait un gel natif pour voir sa conformation à l'état natif! mais j'arrive pas à le réussir, je ne sais pas si c'est à cause du détergent ou du bleu de coomassie, parce que les zones qui étaient plus ou moins colorées ont été bizzarement claires! ........ pouvez vous m'aider?
Bonjour,
1) Quand tu dis un Western blot, qu'as tu fait? un gel? si oui en quelles conditions?
2) à partir de là, si c'est avec un chauffage à 90°C et ou du SDS, sous quelle forme se trouve ta proteine?
3) à quoi sert donc de faire un gel natif? et pourquoi parles tu de détergent en conditions natives?
Pour moi si tu vois plusieurs bandes en SDS-PAGE, c'est que soit: tu as affaire à un complexe, soit une contamination, soit un pb de manip
Cdt.
Bonjour,
Je vous remercie pour votre réponse,
Au fait, ma protéine est une protéine membranaire que j'ai synthétisé en système acellulaire en présence de détergents!
premièrement, j'ai réalisé un SDS-Page puis transfert/révélation par l'anticorps anti-tag pour vérifier la taille du monomère, mais j'ai eu également des bandes qui sont presque au double et le triple de ce poids ....... donc il s'agit probablement de complexes.
Du coup j'ai décidé de faire un gel natif pour voir ma protéine à l'état natif (monomère, complexes ....?) mais j'ai eu des difficultés qui sont dues peut être au détergent, qui pose toujours un problème en gel natif .... et je cherche une solution ....... Voilà en gros.
Bah en fait si tu fais un gel sds tu détruit les liaisons non covalentes et donc ce n'est pas des complexes que tu observes mais des choses qui sont plus grosses.
Ce qui me pose problème c'est que pour un gel natif on ne met pas de détergent pour observer les interactions ou la forme de la prot. Après les gels natifs c'est loin pour moi, mais en tous cas je ne pense pas que tu observes des complexes en sds-page. Si tu as vraiment envie de savoir ce que c'est tu px tjr voir en spectro de masse ap excision de la bande d'intérêt de ton gel suivi d'une digestion in gel par de la trypsine. Bon courage
