Structure secondaire empecherait elle un clonage complet?

[invite92c6beef]

Bonjour à tous, j’espère que vous pourriez m'aider.

je suis en stage je travail sur le clonage de deux variants qui proviennent d'un même gène et qui différent par la présence de deux mutations en position 304 et 535.

Je fais mon clonage dans le pET 100/ directionnel topo, une fois que j 'ai obtenu mes clones, j 'a envoyé à séquencé dans les deux directions (primer de séquençage sont le T7P F et T7 Rev)

j'ai eu des résultats inexploitable avec le T7P deux fois de suite, pour les deux plasmides. mais j'ai pu séquencer avec le T7R
l un des variant était cloner dans le mauvais sens.

pour les résultats inexploitable avec le T7P, la boite m'avait dit qu il pourrait être a cause d une formation de structure secondaire au niveau de mon géne,!! , je voudrais savoir est ce que une structure secondaire au début du gène va empêcher le clonage complet?Si c'était à cause de ça est ce je pourrait comme même cloner la moitié du gène?
et aussi pourquoi je n'aurai pas eu le séquençage des 200 Pb qui séparer mon site de priming de T7P et mon début de géne?

quelqu’un pourrait m'aider à comprendre tout ça ? je vous remercie d'avance
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[invite92c6beef]

Alors personne ne pourrait m'aider :'( ?

[invitec9f0f895]

SAlut

Oui ca peut géner, mais ca risque surtout de géner ta PCR et/ou le séquençage... après il est aussi possible que tu es perdu le site d'attache du primer ce qui fait que celui ci ne fonctionne plus.

Yoyo

[invite92c6beef]

Bonjour yoyo , merci pour votre réponse .
justement je pense que c'est le site d'attache de primer qui a été perdu vu que je n 'arrive même pas à séquencer les 200 paire de base qui sépare le site d'attache de primer et le début du gène, mais est ce vous aurez une idée de la chose qui pourrait causer ceci? et aussi un moyen méthodologique pour éviter ceci la prochaine fois?

merci beaucoup

SFMAH

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitec9f0f895]

Salut

Malheureusement ca arrive de facon aléatoire...

Yoyo