AMPLICON negatif --> devient positif

[invitebeded9b6]

Bonjour, je vous remercie d'avoir repondu à mon ancien post, celà m'a aidé.

Cette fois ci mon souci est le suivant :

A partir d'un meme pool (de mix) que je redistribue ensuite 20µl dans chacun de mes tubes. La moitié me sert à réaliser mon expérience. Les 10 autres servent à amplifier mes amplicons (peut importe de savoir pourquoi je fais çà).

Le résultat de ma 1ère PCR me donne certains positifs et d'autres négatifs, mon positif et négatif sont bien + et -.

Une fois cette 1ère PCR terminée, je prend 5 µl de chacun des amplicons et je les introduis dans chacun des mix (même pool) en commencant par le témoin nég. . Donc aucun contact avec un echantillon positif pour le temoi negatif.

Unr fois la 2nd PCR faite je depose et là tous est + ou légerement + même mon T-.
Manip' réalisée 3 fois en recommencant à partir de mes extractions d'ADN, les 2 PCR et pareil.

Comment celà est il possible?

Merci de me donner des pistes si vous vous le pouvez
-----

[gorben]

Salut

Je resume pour verifier que j'ai bien compris : tu fais une pcr (avec et sans ADN) et tu reprends 5µl de cette PCR pour refaire une PCR dessus.

Si c'est bien ca, ton probleme est que tu as une contamination minime par de l'adn (le plus souvent) ou de l'ADNc (relativement rare).

se servir de son amplicon comme matrice n'est jamais bon.
Combien de cycle tu fais lors de ta premiere PCR?
Comment tu verifies que ton amplicon negatif est negatif?


A+

[invitebeded9b6]

Il ne peut y avoir de contamination de mon T- pour la 2nd PCR puisque'il est du même pool de mix que le premier qui est négatif et que je ne l'ouvre que pour mettre 5µl de ce temoin -.

30 cycles

Je fais un deusieme gel avec les amplicons des amplicons.
Et ce qui me chagrine c'ets qu ela seconde fois mon T- que je réalise à partir de mon 1er T- (sans ouvrir d'autres tubes afin d'eviter une contamination) est + légerement

Merci de ta précédente reponse

[gorben]

Salut,

C'est bien une qRTPCR que tu fais?

Si tu as un T- qui n'est pas negatif, c'est que tu as des restes d'ADN dans ton ARN. Le fait que tu ne le detectes pas lors de ta premiere PCR ne signifie pas que tu n'as rien

Fait le calcul, en imaginant que tu as 1 copie d'ADN genomique au depart. Aprés 30 cycles en admettant que tu doubles tes ADN à chaque fois, tu as 550 000 000 de copies soit pour un amplicon de 200pb grosso-modo 0.01pg d'ADN. Sur gel tu ne detectes rien.
Maintenant imagine lors d'une seconde PCR la dessus ce qui se passe...
C'est pour ca que je te disais qu'il fallait faire TRES attention à tes conclusions quand tu fais une PCR sur une PCR.

A+

[A voir en vidéo sur Futura]

[Yoyo]

salut

la reponse de gorben est la bonne. En fait tu as une amplification que tu ne detectes pas dans ta premiere PCR (ca peut etre une amplification aspecifique). Ce produit ultra minoritaire au cours de ta premiere PCR va devenir majoritaire au second tour, surtout que cette fois les oligos s'hybrideront parfaitement sur le premier amplicon (ce qui n'etait pas forcement le cas lors de la premiere).

Yoyo

[invitebeded9b6]

Merci pour vos réponses

C'est une PCR banale (pas deRT-PCR)

Ok ce que tu me dis c'est que lorsque je réalise mes mix je les contamine ?
Mais des réalisation des mix (sous hote passée aux UV avec décontamination RNaseZAp) je les referme et le T- je le met directement dans le thermocycleur donc aucun contact possible avec la souche en question et lors de la deusieme PCR le T- est repris seul et une partie est transféré dans le mix (identique etréalisé en même temps que le précédent).

Il n'y a jamais eu contact possible avec de l'ADN de ma souche.

De plus la bande correspond au T+ donc ce n'est pas une bande aspécifique.

Les cones utilisées sont à filtre donc même si les pipettes seraient contaminées cela ne changerait pas la donne...

[Yoyo]

Non il n'y a pas de contamination de tes echantillons ou de ton mix, c'est simplement que tes oligos s'hybrident de maniere non specifique (et ils amplifient donc une region qui n'est pas la bonne).

Yoyo

[invitebeded9b6]

Ah ok mais ce que je n'arrive pas à comprendre désolé mais connaissances sont limitées, c'est comment elles peuvent hybridées qqchose sans ADN et s'il y en a des fragments excatement de le même taille de ce que je recherche

[Yoyo]

Bon en fait pour ton temoin negatif il est probable que ca soit une contamination. Les aerosoles sont vraiment une plaie pour les PCR. Sinon ce sont souvent les pipettes qui sont contaminées par de l'ADN.
Sinon ca depend de la taille des fragments que tu cherches a amplifier mais il est aussi possible que tes primers s'hybrident sur eux meme et forme ce que l'on appelle des primer-dimer.

En tout etat de cause tu ne peux rien conclure tant que ton T- est +
YOyo

[invitebeded9b6]

Ok merci bcp çà a répondu à ma question. De toute manière je passe que les doubles PCR si se serait une bonne tkique serait plus utilisé

[invitebeded9b6]

Peut etre est ce aussi du faite que tout ce passe sous la même hotte mix mélange ?

[gorben]

Salut, je me pose juste une question.

Quel interet de faire une pcr sur une pcr si tu observes une amplification de ton echantillon lors de ta premiere PCR?

J'ai deja lu des articles ou les auteurs avaient "trouvés" par double PCR un gene chez une bacterie alors que ce gene n'a jamais été retrouvé dans aucun des 12 genomes sequencé.
Ils avaient amplifié le gene d'un E. coli contaminant...

Les doubles PCR... bof bof, surtout si lors de ta premiere tu detectes une bande!

A la limite, j'essaierai plutot de faire une PCR de 40-45 cycles ou de dupliquer mes tubes.

A+

[invitebeded9b6]

oui c'ets vrai le coup de l'augmentation des cycle sme parait plus pratique et moi sujet à des erreurs .
Merci