Aide : exercice de génétique procaryote

[inviteafc77f31]

Bonjour,

Je suis étudiant en biologie et je suis tombé sur un exercice que je comprends pas trop.
On nous dit que notre objectif est de construire une souche mutante Lac-, appelée L3. Pour ce faire on fait un échange l'allèle muté plasmidique par insertion d'une cassette Cm résistant et l'allèle sauvage chromosomique.

1) Comment construire l'allèle plasmidique muté, les événements moléculaires permettant l’échange entre les 2 allèles, les procédures de sélection et de criblage pour obtenir la souche mutante souhaitée.

Déjà je ne sais pas trop comment faire pour insérer une cassette de résistance dans un gène. transposon contenant Cmr en espérant qu'il s’insère dans le bon gène peut etre ? je ne sais pas trop.
Après pour les évènements moléculaires permettant l’échange je pense que c'est la recombinaison homologue (simple ou double). Les procédures de sélections : un milieu avec du chloramphénicol. Et pour le criblage un southern blot après digestion. D'ailleurs l'allèle plasmidique il est circulaire ou bien linéaire ? Parce que sinon les recombinaison simple ne sont pas possible ou du moins non viable.

Bon je passe toutes les questions de cours facile pour arriver au cœur de mon problème. Cette souche L3 (lac-) est utilisée pour faire une banque génomique dans le plasmide pFB (contient Kan résistance). Cette banque est ensuite introduite dans la souche L3 pour rechercher des plasmides chimérique supprimant le phénotype Lac- de la souche L3. Un tel plasmide est ainsi identifié (WTF ). Nous l'appelons pOM.

2) Pensez vous que pOM porte l'allèle sauvage correspondant au gène muté dans la souche L3 ? => Non, puisque les deux ont l'allèle muté.

3) Comment expliquez vous le phénomène de suppression phénotypique dans ce cas ? => Très bonne question, j'en est pas la moindre idée.

La je ne comprends vraiment pas. On transforme une souche mutante Lac- par son propre ADN contenu dans un plasmide et il y a complémentation, suppression du phénotype.
Comment c'est possible ?


Merci d'avance pour vos réponses,
Ekllypse
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[invitec9f0f895]

SAlut
Je pense que tu as oublié un détail important dans ton énoncé... le plasmide pFB est un plasmide a haut nombre de copies.... ca devrait te mettre sur la voie de la solution

Yoyo

Edit: pour le 1) tu inserts un gène de resistance (cassette) en faisant une coupure par une enzyme de restriction, puis tu inseres par ligation la cassette.

[inviteafc77f31]

Oui effectivement pFB est un plasmide à haut nombre de copies. Mais j'ai du mal a comprendre en quoi ca peut expliquer ce sauvetage de phénotype.
Pour moi un plasmide à haut nombre de copies, est un plasmide qui a un nombre de copie important par cellule.

Donc ... plus de copie = plus de protéines traduites. humm. Il s'agit d'une suppression phénotypique par surexpression ? Je ne vois que ça puisque le vecteur porte les allèles de la souche transformée. La seul chose qui varie c'est le nombre de copie des gènes.

Mais si c'est ça, quel est le gène qui entraine la restauration du phénotype Lac+ lorsqu'il est sur exprimé ? La protéine issu d'un gène tronqué par Cmr ? Un autre gène ?

Ou bien le gène tronqué par Cmr n'est qu'un gène d'une protéine régulatrice induisant la production d'une protéine permettant l'assimilation de Lac. L'apport accru de ce deuxieme gène permet la production de cette protéine sans induction...

Je suis un peu perdu, je ne comprends toujours pas.

Merci de ta réponse rapide YoYo.

[inviteafc77f31]

Désolé, je me permet de vous solliciter a nouveau parce que j'ai vraiment pas compris en quoi le fait que le plasmide soit à haut nombre de copies puisse expliquer le résultat de cette expérience.
J'ai bien essayé de chercher en vous faisant par de mes réflexions dans le message précédant mais je suis toujours perdu.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitec9f0f895]

Salut

Oui tu as tout bon, c'est un suppresseur multicopie (un gène qui n'est pas suppresseur en une seule copie, mais qui le deviens lorsqu'il est surexprimé).
prenons un exemple ca sera plus simple:
le lactose est un sucre qui necessite une permease pour rentrer dans la cellule. Imagine que ton mutant lac- empêche la pénétration du lactose, du coup la cellule est lac-.
tu restaure l'import du lactose en surexprimant une permease qui ne laisse rentrer que 10% de lactose (pas suffisant pour etre lac+) mais si tu as 10 fois plus de copie de cette perméase alors il y a sufisamment de lactose qui rentre pour rendre la cellule lac+.

Yoyo

[inviteafc77f31]

Merci beaucoup pour tes réponses à mes questions.

[invite1767ea91]

La membrane plasmique est le seul système membranaire de la cellule. La membrane plasmique isole l'intérieur de la cellule du monde extérieur, régule la composition du milieu intérieur et fournit l'énergie cellulaire. Les cellules procaryotes ne sont pas compartimentées .