Manipulation génétique chez procaryote

[invite59c4064c]

bijour
voila j'ai un probleme dans la resolution de mon TD , je narrive pas a trouver de reponses qui soit exploitable ,voici l'enonce(assez long):

Les plasmides de type pBR322 ne se repliquent pas dans une souche de E.Coli depourvu d'un gene polA fonctionnel.

Experience 1:
Une banque genomique de la souche sauvage (WT) E.Coli est prepare dans un plasmide pBR322 qui confere la resistance a l'ampiciline(Amp R). Les plasmides recombinants de la banque sont transforme dans la souche L3 de E.Coli dont le genotype est polA. Trois clones L3 Amp R sont ainsi selectionés.L'analyse de restriction des fragments chromosomiques inseres dans chacun des plasmides recombinants laisse penser que la meme region chromosomique a ete a chaque fois cloné. Un de ces plasmides, nommée pL31 est gardé pour une étude plus detaillée.

Experience2:
Le plasmide pL31 est introduit par transformation dans la souche L4 qui contient une mutation conditionnelle dnaAts(thermosensible). La souche L4/pL31 est cultivée a 30°C dans un milieu riche sans ampicilline, pendant 6 heures ;puis une partie de la culture est transfere à 42°C,pendant 16h,l'autre partie etant maintenue à 30°C.
A l'issue des 22 heures de croissance, les 2 cultures ont ensemencées sur boite contenant du milieu riche et de l'ampicilline. Le nombre de bactéries dénombrées a partir de la culture ayant toujours poussé à 30°Cest de 10^8 cellules/ml, tandis que le nombre de bactéries denombres a partir de la culture ayant poussé à 30°C puis à 42°C est de 10^5 cellules/ml

1)Expliquez pourquoi c'est cette region chromosomique qui a ete cloné dans l'experience 1
2) expliquez la difference de numération dans l'experience 2

Je pense que la region qui a ete cloné a pu apporter un nouvo phenotype par mutation(mais je ne sai spas comment)
j'arrive pas a comprendre ce probleme.
Si qqun pourrait m'aider please
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[invitec9f0f895]

Salut

essaye de reflechir a ces questions:
- qu'est-ce qui ce passe quand tu mets un plasmide pBR322 dans une souche polA? les colonies sont AmpR ou AmpS ?

Une fois que tu as répondu a cette question essaye celle la:
- que dois contenir le fragment d'ADN cloné dans le pBR322 pour obtenir le phénotype inverse a celui dont on a parlé a la question précédente?

tu sais ce qu'est une banque d'ADN?

Voila tu as toutes les clefs pour répondre
Yoyo

[invite59c4064c]

si jinsere un plasmide dans une cellule depourvu de polA il ny aura pas replication donc on peut penser a de la transformation par recombinaison homologue non?
Mais quel site a ete transforme
et un banque d'ADN contient le plus de sequence codante du genome etudieé non?
mais je bloque sur cette definition , et dans le deroulement de la resolution de l'exo ,
please help!!!

[invitec9f0f895]

si jinsere un plasmide dans une cellule depourvu de polA il ny aura pas replication donc on peut penser a de la transformation par recombinaison homologue non?

transformation par recombinaison homologue? en quoi la recombinaison homologue a un lien avec la transformation? surtout chez les bactéries! Non ton plasmide se multiplie grace a une origine de réplication.

Mais quel site a ete transforme
et un banque d'ADN contient le plus de sequence codante du genome etudieé non?

Si c'est une banque d'ADNg ca contient TOUT l'ADN codant+non codant.

YOyo

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite59c4064c]

oui bien sur c vrai cest de la transformation jai fait une erreur .donc pas de RH
Mais justement je bloque sur la partie quil est necessaiire de cloner ????
et comment peut on expliquer la difference de 10^8 cel/ml et 10^5 cel/ml dans ces 2 cas?
sil vous plait je galere...

[invitee8702407]

1) On sait que la répliation du plasmide ne fonctionne que s'il y a polA.
On a formé la banque avec génotype [wt] d'E.Coli dans des plasmides Amp^R.

Tu transformes des bactéries E.Coli, polA^-, avec ces plasmides. Si le plasmide (sa séquence intégrée) ne contient pas polA, alors il ne sera pas répliqué et finira par disparaitre. En revanche s'il contient polA il sera conservé.

Voilà pourquoi, les seuls plasmides (3) qui "survivent" laissent penser que la même région (polA) à chaque fois été clonée.

2) Dans l'expérience 3 (que tu n'as pas noté ici), on doit selon moi déduire que l'insert correspond au site OriC sachant que la séquence origine minimum est de 245 nt et qu'ici l'insert en fait 300.
Bref si nous partons de cette hypothèse là, et en connaissant le rôle de dnaA, la différence de numération s'explique un peu plus facilement.
Si nous avons dnaA fonctionnel (donc à 30°C puisqu'il est thermosensible) il y aura production de DnaA, fixation sur les séquences répétés dnabox de l'origine de réplication, et donc réplication.
Dans le cas contraire (à 42°C), dnaA n'est plus fonctionnel, donc les plasmides ne sont plus répliqués et finissent par disparaitre. Ce qu'il ne faut pas oublier, c'est que le plasmide porte Amp^R et que les cultures sont ensemencées sur milieu riche + Amp. Donc pas de plasmide > pas de Amp^R > mort cellule. D'où le fait que le nombre de cellule soit moindre pour celles qui ont subit le changement de température.




Par contre, je me posais une question. Toutes les cellules sont "identiques" (puisque toutes E.Coli). Pourquoi après le changement de températures qui aurait dû toutes les tuer (on y reste 16h quand même...) il y a encore des cellules en fin d'expérience?
Est ce qu'on peut faire l'hypothèse que certains plasmides sont assez résistants pour rester 16h sans se répliquer, survivre, et de nouveau à 30°C recommencer à se répliquer?