Clonage d'un gène eucaryote dans vecteur

[invitefda84ec6]

Bonjour,
je dois réaliser un clonage in silico d'un gène dans un vecteur d'expression eucaryote. (J'utilise ApE).
J'ai les deux séquences et j'ai repéré des enzymes de restrictions pour mon vecteur absentes du gène.
Donc tout irait bien s'il n'y avait pas une consigne en plus : le clonage doit incorporer une étiquette FLAG en C-terminus de la séquence, mais pas d’étiquette de 6 histidines.
Je n'ai jamais été confronté à ça... Je vois sur mon plasmide qu'à la suite du promoteur on a une étiquette FLAG puis une étiquette 6HIS.
Mon idée de départ était de couper le site 6HIS avant d'effectuer le clonage. Problème : pas d'enzyme de restriction qui coupent à cet emplacement sans toucher la FLAG. J'ai essayé plein de trucs (couper plus loin en laissant le même nucléotides qui était coupé en FLAG pour la recompléter par ex.)
Impossible et je ne sias pas si ce serait correct de toute façon!
L'autre solution que j'entrevois c'est de rajouter la séquence de 6HIS sur mes amorces.
Est-ce que c'est possible (dans le sens, ça fonctionne ?)

Je vous joins la carte du vecteur pour éclairer mon propos.

Merci d'avance
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[invitec9f0f895]

SAlut

Dis comme ca, le problème est complexe. tu es sur de ton ennoncé?

YOyo

[invitefda84ec6]

Peut être que je me suis mal fait comprendre...

Voici l'énoncé : Cloner la séquence forkhead box protein P2 isoform I [Homo sapiens] dans le vecteur d'expression pSF-CMV-Puro-COOH-TEV-Flag-6His. Votre clonage doit permettre l'expression du gène à partir du vecteur. Il doit aussi incorporer une étiquette FLAG en C-terminus de la séquence, mais pas d’étiquette de 6 histidines.

[invitec9f0f895]

Salut

Bon c'est bien ca. Le plus simple que je vois (meme si ca me parait étrange vu le plasmide), c'est de cloner ton gène en mettant un FLAG dans tes amorces de PCR afin d'en fair une fusion et de clonner le tout à un site de clonage situé devant TEV. Si tu mets un codon stop apres le flag dans tes amorces, il n'y aura jamais traduction de ce qui suit (mais du coup ca sert à rien d'utiliser un tel plasmide). Autre solution, tu ne mets pas de codon stop, du coup tu aurais une protéine -Flag-Tev-Flag-H6 et tu utilises la protéase pour cliver la deuxième partie. Il te restera donc uniquement le FLAG cloné avant la sequence clivée Tev.

YOyo

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitefda84ec6]

Merci pour votre réponse. Je suis rassuré de voir qu'il n'y pas que moi qui sois surpris par le choix de ce plasmide!

Si tu mets un codon stop apres le flag dans tes amorces, il n'y aura jamais traduction de ce qui suit

C'est à dire que notre gène est traduit mais pas la suite du plasmide (TEV-) ?

Autre solution, tu ne mets pas de codon stop, du coup tu aurais une protéine -Flag-Tev-Flag-H6 et tu utilises la protéase pour cliver la deuxième partie. Il te restera donc uniquement le FLAG cloné avant la sequence clivée Tev.

Du coup, suite à la première question, là aussi si on on coupe, l'intêret est de garder le TEV par rapport à l'autre solution, c'est bien ça ?

J'ai déjà rendu mon travail mais j'aimerais comprendre pour la prochaine fois ! (On n'aura pas de correction)

J'avais coupé en amont de TEV puis après la 6HIS. Est ce que ma protéine serait traduite ? Sinon, pourquoi ?

[invitefda84ec6]

Personne ?

[invite2eb5a45f]

Te prends pas trop la tête. Comme l'a dit Yoyo, cet exercice est débile. On n'utilise jamais un plasmide pareil pour faire ce genre de clonage.