Random priming

[inviteb24177db]

Bonjour ou bonsoir.

Je m'interroge au sujet d'une technique vue en cours de génie génétique : le random priming (amorçage aléatoire en français).
Si je pense avoir bien saisi le principe de la méthode en elle même, c'est son utilisation en laboratoire que je ne comprend pas bien (i.e. dans quelle mesure est-elle utile ?).
En cours, notre prof nous a présenté ça comme étant une technique de sélection par hybridation de gènes d'intérêts à partir d'une banque d'ADN (par exemple).

Mais si l'on utilises des amorces d'oligonucléotides dont les séquences sont aléatoires, comment sais-t-on que lesdites amorces vont venir s'hybrider à la séquence du gène recherché ?
Mon prof m'a répondu que, justement, on utilises surtout cette technique quand la séquence est seulement en partie, voir pas du tout connue.

Ok, mais quand bien même, comment sais-t-on que nos amorces vont s'hybrider spécifiquement sur le gène que l'on cherche à sélectionner et pas ailleurs ? Le but étant, si j'ai bien compris, d'utiliser d'utiliser des marqueurs radioactifs ou fluorescents pour distinguer le gène d’intérêt des autres fragments d'ADN.

D'avance merci à tous ceux qui tenterons de m'aider à y voir plus clair...
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[inviteb24177db]

Up, personne ?
Quelque chose de pas clair dans ma question peut être ?

[vinssss]

Bonjour,

si ça peut aider, personnellement, j'utilise des random primers pour faire des reverse transcription des ARNs totaux. Avec des oligosdT on ne sélectionne que les ARNs messagers qui sont polyA. J'ai aussi utilisé des randoms primers pour la synthèse de sondes radioactives pour Southern blot (produit PCR purifié puis marqué avec un kit dans lequel il y a ces randoms primers en présence de dNTPs radiomarqués)...

[inviteb24177db]

Salut et merci pour ta réponse.
Je suis familier à ces techniques mais cela ne répond pas à mes interrogations de départ.
Je vais éssayer d'être plus spécifiques car je vois qu'il n'y a pas foule là^^.

Est-ce que les techniques de random priming peuvent ou non être utilisées à des fins de sélection d'un gène d'intérêt à partir d'une banque d'ADN génomique (en pratique j'entends, car n'étant pas encore dans le milieu de la recherche, je ne sais pas quelles techniques sont les plus utilisées et pour quoi parmi toutes celles vues en cours) ?

J'ai bien compris le processus permettant d'obtenir des sondes marquées capables de s'hybrider à un ADN donné. Ce que je ne sais pas, c'est comment ces sondes peuvent s'hybrider spécifiquement à une gène d'intéret de séquence inconnue ? Après réfléxion, j'en viens même à me demander si c'est seulement possible via cette technique (et donc ce qu'on utilises en pratique pour faire ça).

[A voir en vidéo sur Futura]

[vinssss]

Bien-sur qu'avec des amorces aléatoires on ne peut pas sélectionner un gène particulier... Tout au mieux on peut faire une amplification totale de la banque proportionnelle à la quantité de départ.

Pour les sondes de Southern blot, elles ne s'hybrident pas à une séquence inconnue mais belle et bien connue. On amplifie par PCR la sonde avec des amorces connues sur une matrice connue et on la purifie. Ensuite, avec des amorces aléatoires, on utilise cet amplicon comme matrice en présence de dNTPs marqués.

[inviteb24177db]

Je vois, merci d'avoir dissipé le doute.
Mais du coup, la question que je me pose c'est : quel est l’intérêt de cette technique pour fabriquer des sondes marquées par rapport à d'autres plus anciennes comme la nick-translation par exemple (cassures dans l'ADN double brin puis repolymérisation avec dNTP radio par une ADN pol I) ? Il me semble avoir lu quelque part que l'idée d'utiliser ces amorces aléatoires avait créé une mini-révolution car cela se révélait beaucoup plus pratique mais je ne vois pas bien pourquoi, puisque ça fait exactement la même chose.

Je me permet d'enchaîner avec une deuxième question/déduction, corrigez-moi si je me trompe :
du coup si l'on souhait sélectionner spécifiquement un gène de séquence non-connue dans un banque d'ADN, la seule méthode serait une sélection par la fonction, non ?

[vinssss]

C'est juste qu'en utilisant un kit de marquage qui contient de RP est plu simple que de le faire à l'ancienne.

Après, pour sortir quelque chose d'une banque d'ADN il y a moulte techniques dont certaines utilisent des RP