Bonsoir,
Dans un exercice, on me demande de trouver un protocole qui me permettrait d'identifier la protéine kinase activée dans la voie de signalisation de la lipolyse (stimulée par l'adrénaline).
La protéine kinase en question ici est la protéine kinase A.
Une personne aurait une idée ?
Merci.
Bonsoir,
J'aimerais que ce soit toi qui essaye de le faire. Quand la PKA est activée elle est comment ? Elle fait quoi ?
Il y a plusieurs protocoles possibles et plusieurs approches.
Moi j'avais pensé à inhiber l'AMPc via l'insuline étant donné qu'elle est AMPc dépendante mais je sais pas si en l'inhibant on identifie forcément la protéine kinase A.
Quand la protéine kinase A est activée, ces sous unités sont dissociées et les sites catalytiques sont à découverts pour phophoryler d'autres protéines.
L'insuline inhibe la lipolyse en activant la phosphodiestérase 3B qui catalyse la conversion de l'AMPc en AMP. Donc moins d'AMPc = moins de PKA activée en effet. Mais il y a beaucoup plus simple que de mettre de l'insuline (tout en enlevant l'adrénaline bien sûr) pour inhiber la PKA. Il existe des inhibiteurs pharmacologiques directs, plus ou moins efficaces dans la vraie vie (j'ai pas regardé en détails).
Et si les inhibiteurs marchent ce qu'on fait en routine c'est qu'on passe à une stratégie d'inhibition par ARN interférent pour confirmer, du style siARN ou shARN. Là on ne va plus cibler la PKA au niveau protéique mais l'ARNm de la sous-unité catalytique de la PKA en empêchant/diminuant la traduction.
Du coup tu viens de citer un outil, c'est-à-dire inhiber la PKA. Il manque le protocole.
Quant à ta dernière remarque oui c'est ça,
Dernière modification par Meiosis ; 06/03/2017 à 22h20.
Le message a été coupé. Oui c'est ça, les 2 sous-unités régulatrices se séparent des 2 sous-unités catalytiques. La PKA activée utilise quoi pour phosphoryler ses cibles ? Quelle est la cible intéressante ici ? Cela devrait te mettre sur la piste.
Merci pour ton aide !
Elle utilise de l'ATP et la cible intéressante ici c'est la LHS (lipase hormono-sensible).
Pour le protocole ce serait plus un mélange de substances dans des tubes plutôt qu'un protocole qui agirait au niveau de l'ARN. Sans les détails, à partir de tubes, on incuberait des adipocyte dans une solution physiologique avec la substance pharmacologique qui inhiberait spécifiquement la PKA.
Mais j'ai cherché sur internet et je n'ai trouvé aucuns résultats sur une substance qui agirait sur la PKA directement.
Tu as l'inhibiteur H89 par exemple, ça se trouve rapidement sur google.
Ce serait de la culture cellulaire avec une lignée d'adipocytes (souris ou humains).
Donc tu vois que la PKA utilise l'ATP pour phosphoryler la LHS au niveau de plusieurs sites, en cherchant dans la biblio on voit qu'il s'agit principalement de la sérine 563, sérine 659 et sérine 660. Apparemment la biblio dit que la phosphorylation de la sérine 563 joue peu dans l'activité de la LHS donc on va éviter de l'utiliser dans le protocole.
Quoi de mieux qu'un western blot pour mettre en évidence une phosphorylation ?
Les conditions seraient donc :
1- Sans rien du tout pour avoir le niveau basal de phosphorylation (il peut exister) donc c'est le contrôle
2- Adrénaline seulement dans le milieu de culture
3- H89 seulement (devrait diminuer le niveau basal s'il existe, voire l'annuler complètement)
4- H89 + adrénaline (à comparer avec la condition 2 pour montrer que c'est bien par l'intermédiaire de la PKA activée que l'adrénaline active la LHS, donc stimule la lipolyse)
Donc en 2 on devrait avoir plus de phosphorylation pour la LHS qu'en 4.
À côté de ça (qui reste la théorie) tu as toutes les considérations expérimentales qui entrent en jeu : quel(s) anticorps utiliser ? Quelle lignée cellulaire utiliser ? Pourquoi ?
Est-ce que mon inhibiteur est assez fort ? À quelle concentration l'utiliser ?
Si tu as une augmentation de LHS phosphorylée en western blot tu dois aussi t'assurer que ce n'est pas dû au fait que tu aurais pris plus de protéines d'une condition à une autre, comment ferais-tu pour le vérifier ?
De plus en western blot tu peux avoir plus de LHS phosphorylée mais ça ne suffit pas pour avoir une bonne démonstration. Il faut montrer que cette plus grande quantité de LHS phosphorylée est due à une plus grande activité de la LHS et non pas à une plus grande expression de la LHS. Dans ce dernier cas on pourrait en effet croire que puisqu'il y a plus de LHS disponible alors la PKA peut en phosphoryler davantage, d'où une plus grande quantité de LHS phosphorylée.
Comment montrerais-tu que c'est dû à une plus grande activité de la LHS et non à une plus grande expression de la LHS ?
PS : in-vivo il y a peut-être également une augmentation d'expression de la LHS en plus d'une augmentation de l'activité de la LHS mais je n'ai pas trouvé de sources concernant ceci. Mais déjà on va faire comme si ce n'était pas le cas pour ton problème.
