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Western blot



  1. #1
    imenekrossa

    Western blot


    ------

    Bonjour,
    Je suis actuellement étudiante en Master 1 de génétique et je fais mon stage dans un labo de génétique et je fais beaucoup de Western Blot sur des lysats issus de lignées de liposarcomes. A chaque révélation des bandes, je constate que les bandes du contrôle que je met (la tubuline) ne sont pas identiques d'un puit à l'autre ce qui suggère que je n'ai pas déposé la même quantité de protéine dans chaque puit, mais pourtant je fais bien attention de bien déposer la même quantité de 20µl par puit (30µg de prot pour un QSP de 40µl avec du tampon de laemmli et du tampon de charge. Je fais 2 gel en même temps donc je dépose 20µl du même échantillon dans deux puit, un de chaque gel ) et bien évidemment le dosage protéique à bien été effectué et les calculs ont bien été effectués, comme je l'ai dit plus haut, je dépose 30µg donc je divise 30 par la valeur obtenue suite au dosage de l'échantillon protéique. Quelqu'un aurait une idée sur pourquoi l'intensité des bandes de la tubuline n'est pas identiques d'un puit à l'autre ? merci

    -----

  2. Publicité
  3. #2
    DocBrownd

    Re : Western blot

    Bonjour,
    en fait il est très souvent difficile de réaliser exactement le même dépôt, d'où ces variations. De plus, suivant la méthode utilisée pour doser la concentration en protéine on est +/- précis. C'est pourquoi normalement pour toute quantification on utilise un rapporteur interne qui normalement ne varie pas dans les conditions testées (souvent l'actine ou la tubuline) et on rapporte le signal obtenu pour notre échantillon au signal obtenu pour le rapporteur (une division quoi ^^). Et bien évidemment on fait ça sur le même gel (vu qu'on peut pas quantifier entre 2 gels).
    Dernière modification par DocBrownd ; 18/04/2017 à 14h48.

  4. #3
    Flyingbike

    Re : Western blot

    votre dosage est-il correct ? c'est facile de faire n'importe quoi et je le vois tous les jours


    Vous pouvez faire une coloration au rouge ponceau après transfert, ça peut donner une idée

    et la tubuline n'est pas obligée de vous obéir et de ne pas varier !
    La vie trouve toujours un chemin

  5. #4
    imenekrossa

    Re : Western blot

    Le dosage protéique a été effectué correctement. Je dois soumettre mes échantillons a différentes conditions (avec et sans inhibiteur) pour voir l'abondance d'expression des mes protéines selon la condition adéquate, donc il est impératif que la tubuline soit intacte pour tout mes puits pour que je puisse quantifier. Je ne cherche pas juste a savoir si ma protéine est la ou pas.

  6. #5
    imenekrossa

    Re : Western blot

    Citation Envoyé par imenekrossa Voir le message
    Le dosage protéique a été effectué correctement. Je dois soumettre mes échantillons a différentes conditions (avec et sans inhibiteur) pour voir l'abondance d'expression des mes protéines selon la condition adéquate, donc il est impératif que la tubuline soit intacte pour tout mes puits pour que je puisse quantifier. Je ne cherche pas juste a savoir si ma protéine est la ou pas.
    je me demande pourquoi je continue a faire un truc qui ne me plait pas
    Dernière modification par imenekrossa ; 19/04/2017 à 08h54.

  7. A voir en vidéo sur Futura

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