contrôle positif PCR

[AlessandraM]

Bonjour tout le monde,

je suis assistante ingénieur dans un laboratoire d recherche. j'ai un petit problème avec les contrôles positifs pour mes PCR: juste après quelque semaine , (si j'ai de la chance) la bande est très faible, mais il m'arrive de la perdre complètement.

j'ai fait des petits aliquotes de 10 microlitres exprès pour éviter de les décongeler trop souvent (j' utilise 5microlitres/PCR), et on les met dans de l'eau. est§ce que à votre avis le TE serait mieux pour les conserver?

c'est la première fois que ç m'arrive et on n'arrive pas à comprendre pourquoi ils se dégradent si vite.

Merci d'avance pour votre aide=

Alessandra
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[Flyingbike]

C'est de l'ADN ? double brin ? issu de quoi ? PCR de quel type ?

[AlessandraM]

c'est de l'adn, genotypage à partir de bout de queue de souris. programme classique d'une PCr, on veut juste reconnaitre les animaux hétérozygotes (deux bandes) des wt (1 bande). C'est assez simple, mon contrôle positif doit avoir deux bande, mais souvent ça marche une seule fois et la semaine d'après les bandes ont disparu. je change de contrôle (je garde les tube des souris déjà testé comme comme contrôle), mais c'est la meme chose....

[Flyingbike]

Comment est extrait l'ADN ? Est il dosé ? 5µL par PCR ça fait quelle quantité ?

Pour avoir fait ce genre de PCR, l'ADN n'a même pas besoin d'être congelé et est stable pendant des semaines a 4° (sous réserve qu'il soit a peu près propre)

Si vous aliquotez votre ADN et que vous en sortez un nouveau a chaque fois, aucune chance qu'il se dégrade en étant congelé.

Et oui, c'est plus stable et plus soluble dans le TE (mais a mon avis le problème est ailleurs).

[A voir en vidéo sur Futura]

[Loupsio]

Que donne le dosage Nanodrop?
courbe correct?
ratios?
quantité en nmol/µL?