Bonjour tous,
J'aimerais comparer le nombre de cellules présentes dans un certain volume de sang au nombre de cellules présente dans un échantillon de selle de même volume. Pensez vous que je puisse utiliser un "housekeeping gene" pour cette quantification?
En fait l'objectif de mon étude est de comparer le seuil de détection d'un parasite dans 3 fluides biologiques différents par PCR.
Merci
quantifiez l'adn génomique !
La vie trouve toujours un chemin
Oui mais est ce que justement on pourrait faire une normalisation, en se disant qu'une certaine quantité d'ADN génomoque correspondrait à une quantité de cellules donnée dans chaque échantillon?Envoyé par Flyingbike
Bah c'est ce qu'il y'a de moins pire
Puisque compter les cellules est impossible
Quantifier l'adn est impossible aussi (dans les selles il y a plein d'ADN non hôte)
Ça me paraît être une bonne solution
La vie trouve toujours un chemin
Ce que j'ai envie de faire c'est de d'amplifier un gène de ménage (spécifique à l'Homme) dans un volume d'échantillon de sang donné puis amplifier le même gène dans le même volume d'échantillon de selle, puis faire une normalisation par dilution des quantités d'ADN. Qu'en pensez vous?
Pourquoi un gène de ménage ? Prenez n'importe quel couple d'amorces génomiques, il fait quantifier l'ADN et pas les transcrits
À votre place j'etalonnerai avec une gamme obtenue avec des quantités décroissantes d'ADN extrait d'une quantité de cellules connue (pour avoir une quantification en nombre de cellules)
La vie trouve toujours un chemin
Merci, je vais faire cela.
Si j'ai d'autres soucis je reviendrais vers le forum. Tout compte fait je vous tiens informé
Le gène de ménage c'est parceque c'est un gène qui est exprimé dans tous les types cellulaires et ne subit pas de régulation. La transcription d'autres gènes autre que les housekeeping gene peuvent modulé et donc biaisé notre étude
oui, je sais bien ce que c'est
Mais dans votre cas, vous ne mesurez pas un transcrit, mais une quantité de cellules. Mesurer un transcrit (que ce soit d'un housekeeping gene ou de n'importe quoi d'autre) introduit un biais, car (par expérience) même un gène considéré comme référence n'est pas utilisable quand on compare des tissus différents !
Pour éviter cela, et vu que vous vous intéressez à la quantité de cellules, je propose de mesurer une quantité d'ADN génomique, qui ne varie pas et est toujours proportionnelle à la quantité de cellules (sauf exception). En mesurant n'importe quelle cible dans l'ADN génomique, on peut remonter a la quantité de génomes, et donc de cellules.
On pourrait normaliser par la quantité totale d'ADN, bien plus facile a mesurer (pas besoin de qPCR par exemple), mais votre problème est que dans les selles il y a des cellules non eucaryotes pleines d'ADN qui sera quantifié en même temps.
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Et les vieilles techniques de comptage de cellules au microscope, elles sont totalement obsolètes?
Toi t'as jamais essayé de compter des cellules dans du caca......
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non en effet, je n'ai même jamais approché un microscope à moins d'un mètre.
attention au fait que dans le sang il y a beaucoup de cellules qui n'ont pas d'ADN, et qui peuvent être parasitées.
C'est vrai j'avais oublié c'est un des arguments pour lesquels je voulais utiliser un "housekeeping gene", les érythrocytes n'ont pas d'ADN génomique ce qui conforte mon idée de travaillé avec un "housekeeping gene".
Merci
si c'est du sang humain les labos d'analyses médicales font en routine des "numérations" d'érythrocytes et de leucocytes (en distinguant plusieurs types je crois).
Si vous voulez quantifier des cellules dans des tissus différents, c’est pas une bonne solution
Comme vous voulez !
Faudrait en dire plus dans ce cas là
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Je travaille sur la détection d'ADN parasitaire de P. falciparum qui a un tropisme pour les érythrocytes. Des études ont montré que ce parasite peut être retrouvé dans les selles, la salive et même l'urine (du moins son ADN). Ceci dans le but de développer de nouvelles méthodes non invasives (qui ne nécessitent pas une piqûre) de diagnostic du paludisme. Lors de mes premières expérimentations j'ai pu mettre en évidence que ce parasite pouvait etre présent dans les différents fluides biologiques sus-mentionnés.
Mon problème c'est que je veux normaliser cette détection dans les différents fluides, je m'explique: est ce que on détecterait plus d'ADN dans le sang parce que par exemple dans 10µl de sang on a beaucoup plus de cellules que dans 10µl de fèces ?
Ceci est à titre indicatif, c'est pour nous rapprocher de la réalité je sais que dans le sang il y a bcp de types cellulaires ainsi que dans les fèces.
Je sais pas si mes explications sont on ne peut plus claire.....
Merci
oui, du coup si c'est un parasite des erythrocytes c'est plus difficile, mais pas sur qu'un transcrit permette cette comparaison (du moins sans étalonnage préalable).
Pourquoi pas en utilisant un marqueur cellulaire bateau en fluo (commun a toutes les cellules, donc non nucléaire), et en dénombrant au cytomètre ? C'est rapide et assez précis, mais je ne sais pas ce qui est utilisable dans ce cas...
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dans les fèces il risque d'y avoir plus de cellules et plus d'ADN provenant des organismes ingérés que de l'auteur desdites fèces.
qui auraient survécu à la digestion ?
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Il y a de l'ADN et des cellules, et même des objets plus gros que des cellules, par exemple des graines de végétaux. C'est même un mode de dispersion des graines pour certains végétaux.
Oui bien sûr
Mais il est facile de discriminer des cellules de l’hote dans ce bazar (les cellules libres ingérées devraient être détruites je pense )
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