nucléase

[win04]

Bonsoir,
Dans mon cours les nucléases sont décrites comme étant des enzymes permettant de couper entre deux nucléotides seulement voila on distingue les nucléases a bout franc des nucléases a bout cohésifs en effet les nucléases a bout franc coupe sur les deux brins d'adn tandis que les nucléases a bout cohésifs coupent seulement sur 1 brin d'ADN.

La question que je me pose est pourquoi dans mon cours est-il dit que les coupures a bout cohésifs induisent quasiment tout le temps une réassociation des brins tandis que a bout franc non ou rarement.

De plus j'aimerais alors dans le cas de coupure cohésive l'utilisation de deux enzymes différentes est indispensable pour éviter la réassociation ?

merci de votre aide
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[dalmia]

Hello,

Alors attention, les nucléases qui génèrent des bouts cohésifs coupent bien deux brins mais pas au même endroit (quelques bases de distance).
Comme une des plus connue Eco RI qui coupe de cette façon :
5' G/AATTC 3'
3' CTTAA/G 5'

Si tu coupes au même endroit, les extrémités n'ont pas de propriétés spécifiques permettant de les réassocier.
En revanche, après coupure par notre Eco RI pour garder l'exemple de bouts cohésifs, tu vas générer une extrémité monobrin 5' AATT 3' et une autre 3' TTAA 5'.

Ces courtes sections monobrins sont complémentaires l'une à l'autre ! Les adénines peuvent s'apparier aux thymines avec la formation de 2 liaisons hydrogènes (c'est une renaturation en fait). Avec une coupure franche, pas de section monobrins générées, tu ne peux pas réapparier sur le principe de complémentarité.

Si tu coupes avec deux enzymes différentes, les extrémités générées ne seront pas complémentaires l'une à l'autre puisque les enzymes vont couper différemment (le site de restriction n'est pas le même et le type de coupure non plus).

Je me permets d'ajouter un truc concernant cette histoire d'éviter que deux extrémités ne se réassocient :
Le moyen couramment utilisé en labo est de virer le groupement phosphate des extrémités 5' générées après coupure. Pourquoi ne voudrais-tu pas que ça se réassocie : exemple, tu veux exprimer une protéine dans une bactérie pour l'étudier. tu insères le gène codant pour ta protéine dans un plasmide d'expression bactérien qui contient donc une cassette de clonage. Tu commences par ouvrir ton plasmide avec une enzyme de restriction, tu fais agir ta phosphatase, et tu peux ensuite tranquillement faire ta réaction de ligation entre ton transgène et le plasmide (et ainsi éviter que ton plasmide ne se referme sur lui-même et d'avoir bossé pour rien).

J'espère t'avoir éclairée,
Dalmia

[win04]

Coucou Dalmia !
Un grand merci de m'avoir éclairé ! Ton explication m'a été d'une grande aide comme d'habitude haha!

[dalmia]

Il n'y a pas de quoi

Est-ce que ta question concerne un contexte de clonage ? Je veux dire par là, ouvrir un plasmide, liguer un insert, le faire exprimer par une bactérie.
Parce que si oui, découper ton plasmide par deux enzymes différentes est important 1. non seulement pour éviter qu'il ne se referme sur lui-même mais aussi 2. pour que tu puisses ORIENTER ton insert.
Admettons voilà ton plasmide ouvert par deux enzymes différentes, une bleue une violette : ---------PROMOTEUR---------site Enzyme de restriction 1 (du vide) site Enzyme de restriction 2------- TERMINATEUR---------et on rejoint le promoteur puisque le plasmide est circulaire.

Ton insert (j'entends par là la séquence codante de ton gène d'intérêt) (putain c'est tellement plus pratique d'expliquer en parlant et avec un tableau ) ben il a un sens, la séquence doit être lue dans ce sens et pas dans l'autre. Allez, un exemple : ton gène fait 9 pb :
5' AAAAACCCC 3'
3' TTTTTGGGG 3'
Ta protéine fait donc 3 acides aminés (on est dans de la science fiction hein ) puisqu'on a 3 triplets AAA puis AAC puis CCC (puis 3 codons, 3 aa). Si ton insert se fout dans l'autre sens, càd comme ça dans ton plasmide :
5'GGGGTTTTT 3'
3'CCCCAAAAA 5'
(je précise que c'est exactement la même molécule double brin dessinée retournée) eh ben tu vas pas du tout avoir la même protéine ! Puisque les triplets lus deviennent GGG, GTT puis TTT (avec les codons et les aa correspondants).

Tu vas donc ajouter, par PCR et grâce à la séquence de tes amorces, des nucléotides en amont et en aval de ton gène : en amont, les nucléotides qui correspondent au site de restriction de l'enzyme 1, en aval, les nucléotides qui correspondent au site de restriction de l'enzyme 2.

De cette façon, tu ne peux insérer ton gène que tu cherches à exprimer que dans le bon sens

Est-ce que cette précision est cool, où je suis partie dans un délire qui t'a embrouillée ?

Dalmia <3

[A voir en vidéo sur Futura]