Bonsoir,
La spectrophotométrie est une méthode permettant de suivre la purification des protéines en faisant appel aux caractéristiques des acides aminés aromatique visible a 280 nm.
Seulement voila je ne comprends pas en quoi cela permet de distinguer les protéines du reste du culot ?
Un grand merci de votre aide
Bonjour,
Comme tu le dis il s'agit d'une méthode pour suivre la purification des protéines c.a.d observer la quantité de protéines (par exemple) à un instant T. Cependant, il faut d'abord purifier les protéines par exemple en colonne d'exclusion par la taille (ou toutes autres méthodes) tu récolte au fur et à mesure dans des béchers puis direction cuve de spectro pour avoir une idée de la quantité (il y a ou pas et en quelle proportion). Du coup si tu connais la taille de ta protéine (pour notre exemple la taille mais cela peut être son poid, sa charge...) et que tu détectes un pic tu sais que c'est elle et tu gardes ta fraction !
Ici un schéma : http://biochimiedesproteines.espacew...e.ca/filtr.gif
Les particules rouges sont les plus grosses et sortent en premières donc premier pic tu conserves cette fraction et ainsi pour toutes tes protéines.
Boson197
Coucou Boson197
Un grand merci pour ton lien et ton aide !
Seulement ce que je ne comprends pas c'est comment on arrive a discriminer les protéines a partir de la propriété sur les AA aromatique ?
Bonjour,
On ne peut pas discriminer des protéines en mesurant l'absorbance à 280nm. La seule information qu'on peut en tirer, c'est la présence ou non de protéines contenant des AA aromatiques dans la solution. On peut éventuellement déterminer la concentration d'une solution contenant une seule protéine si on connaît le coefficient d'absorption de celle-ci.
Bonjour,
Par contre tu peux utiliser une colonne d'exclusion par la charge si tu connais la charge des protéines a discriminer (si elles contiennent des AA aromatiques chargé). Avec l'absorbance comme la dis @TanguyE c'est impossible.
Hello !
Pendant ma thèse, j'ai exprimé et purifié une protéine avec une forte affinité pour les ARN, donc des acides nucléiques. En début de manip, le pic d'absorption de mon échantillon se situait à 260 nm, ce qui correspond aux AN. Après 2 colonnes si je me souviens bien (une première Ni-NTA pour isoler ma protéine avec un tag histidine) puis une deuxième selon la charge, UnoQ il me semble, bref, mon pic se situait à 280 nm, ce qui témoignait de l'élimination des AN puisque ce pic d'absorption correspond aux protéines (260 VS 280 nm). C'est un contexte un peu particulier peut-être mais je trouve qu'il illustre bien l'intérêt de suivre le profil d'absorbance d'un échantillon au cours d'une purif.
Très bonne fin de journée
Dalmia
