Bonjour,
Voila, j'ai étudié la méthode de RNA seq se déroulant comme ceci :
conversion de l'arnm en adnC puis fragmentation puis PCR des fragments et ensuite dans le sequenceur on obtient plus ou moins de A,T,C,G
Tout simplement j'ai recherché sur plusieurs sites mais je ne comprends pas l'objectif de cette méthode... et si quelqu'un pourrait me la réexpliquer plus en détails je serais comblée
Merci de votre aide !
Hello !
Alors pour replacer le vocabulaire adéquat, "conversion de l'ARNm en ADNc", ça s'appelle une RT-PCR (RT pour reverse transcriptase). Cette technique suivie de séquençage sert à étudier l'expression des gènes d'une cellule donnée.
Mon expérience perso à titre d'exemple : mon sujet de recherche portait sur l'effet de la salive de tique sur les gènes des cellules de peau. Je voulais savoir exactement quels étaient les gènes dont l'expression était modifiée par la piqûre de tique. J'avais donc des échantillons de peau saine (pour avoir un profil en conditions normales) que j'ai comparés à des échantillons de peau prélevés localement sur un lieu de piqûre de tique. RT-PCR, analyses des amplicons obtenus : j'ai pu constater notamment l'induction de gènes de l'immunité cutanée. Dans mon cas c'était une manip super délicate pour être vraiment quantitative (il me semble avoir fait du semi-quantitatif par prudence, mais je n'ai pas eu le temps de mettre au point pour améliorer la précision de ma manip), peut-être que d'autres protocoles ou d'autres échantillons permettent d'être super précis. Mais voilà pour les grandes lignes.
Il y a d'autres applications, comme du diagnostic pour la détection de cancer ou de présence d'un pathogène.
Dalmia
OH MERCI ENORMEMENT DALMIA !!!!!!!!!
Juste pour être sure après avoir obtenu la séquence adéquate dans le cas de ton experience la RNA seq t'as permise de mettre en evidence une induction de gènes ? tu as comparé les deux séquences nucléotidiques ? Mais en fait ce qui me chiffonne c'est pourquoi utiliser particulièrement la RNA seq et pas par exemple la méthode de Sanger ?
Merci de ton aide
desolé je reviens a l'attaquepourquoi utiliser le rna seq et pas le système ion torrent ou encore le pyrosequencage ???? Desolé haha peut etre je suis complètement a l'ouest c'est juste cette méthode me chiffonne dans le sens ou le résultat peut s'obtenir via d'autres méthodes enfin si je me trompe pas alors qu'est ce qu'elle a de particulier ?
on cherche a qualifier et quantifier des TRANSCRITS, donc des messagers (ou des miRNA). Il faut donc séquencer des ADN obtenus à partir des ARN
Pour Sanger il faut une amorce, ce qui implique de connaître le transcrit qu'on cherche, dans ce cas la on fait de la qPCR.
Le RNAseq est une méthode a haut débit = on a un aperçu de tous les transcrits et leur abondance relative dans un échantillon
La vie trouve toujours un chemin
Salut Flyingbike ! Merci de m'avoir répondu !!!
Mais dis moi en quoi connaître l'abondance des transcrits est intéressant pour la suite ? Enfin j'imagine que du coup on peut effectuer une comparaison et se rendre compte qu'il y a ou non des différences avec un autre ? c'est bête mais je vois pas trop l'interêt de cette méthode connaître l'abondance des transcrits oui... mais pourquoi concretement ?
Desolé je suis lente a comprendre
Quantifier le niveau d'expression d'un gène peut être très intéressant pour la recherche fondamentale et appliquée. Pour mieux caractériser un mécanisme moléculaire (recherche fondamentale plutôt) voire l'exploiter pour l'élaboration d'un traitement (plus du côté de la recherche appliquée). Par exemple, le parasite du paludisme est capable d'infecter les hépatocytes. Cette infection entraîne une translocation d'un facteur de transcription cytoplasmique vers le noyau (ce bon vieux NFKB). Celui-ci va activer l'expression de tel gène 1000 fois, tel autre gène 200 fois, etc, et ça on le sait grâce au RNA seq notamment. On comprend mieux quelles sont les conséquences, les effets de l'infestation par ce parasite. ça n'est qu'un exemple parmi des millions d'autres.
Dalmia
J'ai un autre exemple pour démontrer l'intérêt de quantifier des transcrits (je sors du RNAseq là pour aller vers une recherche spécifique). Admettons qu'une personne soit malade à cause de la quasi absence de la protéine X. Tu veux identifier l'origine du problème. Tu peux chercher du côté de l'ARNm correspondant à cette protéine : si les ARNm sont présents en quantités normales, alors c'est un problème traductionnel ou post-traductionnel. Si les ARNm sont peu ou pas présents, ça veut dire qu'on a un problème au niveau de la transcription. Tu "dépiautes" quoi, tu dissèques étape par étape
Dalmia
Merci encore de ta précieuse aide cela m'aide vraiment quand tu utilises la méthode dans un exemple concret de la vie réelleEnvoyé par dalmia
J'ai un autre exemple pour démontrer l'intérêt de quantifier des transcrits (je sors du RNAseq là pour aller vers une recherche spécifique). Admettons qu'une personne soit malade à cause de la quasi absence de la protéine X. Tu veux identifier l'origine du problème. Tu peux chercher du côté de l'ARNm correspondant à cette protéine : si les ARNm sont présents en quantités normales, alors c'est un problème traductionnel ou post-traductionnel. Si les ARNm sont peu ou pas présents, ça veut dire qu'on a un problème au niveau de la transcription. Tu "dépiautes" quoi, tu dissèques étape par étape
DalmiaJ'ai tout compris !!
HelloJ'ai un autre exemple pour démontrer l'intérêt de quantifier des transcrits (je sors du RNAseq là pour aller vers une recherche spécifique). Admettons qu'une personne soit malade à cause de la quasi absence de la protéine X. Tu veux identifier l'origine du problème. Tu peux chercher du côté de l'ARNm correspondant à cette protéine : si les ARNm sont présents en quantités normales, alors c'est un problème traductionnel ou post-traductionnel. Si les ARNm sont peu ou pas présents, ça veut dire qu'on a un problème au niveau de la transcription. Tu "dépiautes" quoi, tu dissèques étape par étape
Dalmia
tout ce que dit Dalmia est vrai. Mais par contre cet exemple est un peu inadapté. Le RNAseq, c'est en gros savoir a un instant t quels sont les gènes exprimés par une cellule, ou un tissu, ou un organe, et en général on compare deux ou plusieurs situations (un témoin, des cellules traitées avec une molécule x, ou bien un tissu sain et un tissu cancéreux, etc)
Cela génère beaucoup d'information par échantillon, ça n'est pas exhaustif mais ça ratisse large. De ces infos, on peut en confrontant les résultats a des bases de données, dégager des indices du genre "cette molécule active des gènes impliqués dans le stress oxydant, ou bien cette autre molécule modifie l'expression de gènes du cycle cellulaire, etc. C'est du débroussaillage.
Quand on s'intéresse a un gène X, comme dans l'exemple de Dalmia, on ne choisira pas de faire du RNAseq parce que c'est cher, et parce que ça génère beaucoup trop d'infos, et aussi parce que cela prend du temps (et c'est un truc qui est généralement fait par un prestataire). A sa place, je ferai plus simplement de la PCR quantitative en ciblant X.
La vie trouve toujours un chemin
C'est exactement pour la raison que tu exposes que j'ai précisé que je sortais du contexte du RNAseq dans mon exempleMais je suis certaine que ta réponse éclaire win04 et tu ajoutes justement que c'est la qPCR qui est adaptée.
Dalmia
Bonjour à tous,
Est-ce que quelqu'un a déjà fait de l'analyse de données (format .bam) de RNA-seq et aurait quelques pistes à donner (outils plus "user friendly" que d'autres, scripts quelconques, etc..)?
Je débute et l'analyste m'a envoyé des .bam reverse et .bam forward (+.bai) en me disant qu'il s'agit des reads alignés et point... :/
D'après ce que j'ai lut, il faudrait commencer par processer les reads en gene counts->les normaliser ->assigner les reads aux genes correspondants -> passer à l'analyse différentielle des gènes..
Aussi, je me demandais si un variant call était nécessaire pour ces données issues de NGST (pour les puces, non)...
Merci d'avance pour votre aide (beaucoup!)
