Bonjour à tous,
Je suis actuellement en stage de M1 et je dois déterminer l'activité de l'asparaginase purifiée d'Escherichia coli par la mesure de la quantité d'ammonium libérée lors de l'hydrolyse de son substrat la L-asparagine.
J'ai réalisé une gamme étalon (de 100 à 1000 µM dans du tampon Tris-HCl à 50mM, pH 8.6 que je nommerai standard) en microplaque à l'aide d'ammonium sulfate à partir d'une solution mère à 100mM. Pour cela j'ai ajouté dans chaque puits d'une microplaque 20µL de standard + 280µL d'H2O + 40µL de réactif de Nessler. J'ai laissé incuber 1min avant de lire l'absorbance à 436nm. Pour le blanc j'ajoute 20µL de Tris-HCl à 50mM, pH 8.6. J'obtiens une jolie droite linéaire (R² = 0.99, y = y=0.0002535091x – 0.0030727273)
J'ai ensuite voulu déterminer l'activité spécifique de mon asparaginase purifiée. Pour cela j'ai incubé 1.5µL d'enzyme à 0.1mg/mL + 25.65µL de Tris-HCl, pH8.6 + 2.85µL de substrat L-asparagine (à 0.1M). Après 10min de réaction à 37°C la réaction est stoppée par ajout de 1.5µL de TCA (1.5M). J'ai centrifugé pour clarifier la solution. J'ai ensuite mesuré la quantité d'ammonium libérée en ajoutant 20µL de surnageant + 280µL d'H2O + 40µL de réactif de Nessler. J'ai laissé incuber 1min avant de lire l'absorbance à 436nm. Pour le blanc j'ajoute 20µL de Tris-HCl à 50mM, pH 8.6.
A partir de la droite d’étalonnage j’ai déterminé que pour une absorbance de 0.2401 obtenue (après soustraction du blanc) cela équivalait à 935µM d’ammonium. C’est à partir de là que ça se complique pour moi pour déterminer l’activité spécifique de mon enzyme.
Par définition, 1U équivaut à la libération d’1 µmol d’ammonium par mL à 37°C et à pH 8.6.
La formule pour le calcul : U/mL = (µmol d’ammonium libéré * volume total de la réaction (31.5µ)) / (Volume prélevé de la réaction (20µL) * temps de réaction (10min) * volume d’enzyme utilisée pour la réaction (1.5µL à 0.1mg/mL)).
Je n’arrive pas à savoir comment déterminer l’ammonium libéré en µmol sachant qu’une mole d’ammonium sulfate équivaut à 2 mole d’ammonium ? Pouvez-vous m’éclairer ?
Merci beaucoup !
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Re : Activité spécifique de l'asparaginase par la méthode de Nessler
