PCR colonie et PCR ADN

[invitee09974cd]

Bonjour,

J'ai quelques soucies de positifs/négatifs dans mes PCR.
Je vous explique...

J'ai réalisé des transformations de Bl21 à la suite de clonages sur plasmide (avec enzyme de restriction).
J'ai obtenu de nombreuses colonies. J'en ai récupéré une vingtaine.
J'ai réalisé une PCR sur colonie pour tester la présence de mon insert (oligo dans l'insert). Environ la moitié étaient positifs.

Du coup, j'ai réalisé une miniPrep de l'ADN plasmidique.
Je l'ai à nouveau testé par PCR avec les mêmes oligo que pour la PCR colonie.
Et là, je n'ai plus aucun positif. Je n'amplifie plus rien.
J'ai tout de même envoyé à séquencer, et confirmation, mes plasmides ne contiennent plus rien (en tout cas rien ne ressort, je ne trouve plus mon insert).

J'ai tout de même déposé mon plasmide sur gel après la MiniPrep, il est toujours présent.
Demain je vais essayer de le digérer pour voir s'il contient bien un insert ou non...

Pourriez-vous m'aider s'il vous plaît ? Je ne comprends pas pourquoi mon insert est présent lors de ma PCR colonie, puis disparaît à la suite de la MiniPrep...

Merci par avance !
-----

[Flyingbike]

Vous avez toujours une sélection pour la culture entre la colonie et la miniprep ?
Est ce que la PCR a été séquencée ? Ça ne pourrait pas être un produit non spécifique ?

[invitee09974cd]

Bonjour Flyingbike,

Entre la colonie et la miniprep, je réalise une PCR-colonie pour vérifier la présence de mon insert. J'effectue la miniprep sur celles qui possèdent l'insert.

Le séquençage que j'ai réalisé était sur les produits de ma miniprep. N'y ayant vu aucun insert, j'ai décidé de les vérifier par PCR sur les ADN obtenus suite à la miniprep. Et il n'y avait plus rien.

Un produit spécifique je veux bien, mais je ne comprend pas comment...
Mes oligo sont dans le gène, qui n'est pas censé se trouver dans le génome bactérien. De plus, lors de mes PCR, j'utilise un insert comme témoin positif. La taille de bande correspond...

[Flyingbike]

Mais pour faire la miniprep, vous faites une culture liquide à partir de la colonie ? Avec antibio ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitee09974cd]

Oui bien sur. Je récupère la colonie, prend une partie pour la PCR-colonie et le reste est mis en culture liquide avec antibiotique.

[Flyingbike]

Ce que je ferais, c’est une pcr sur la culture liquide (vous prenez genre 200uL, pcr sur le culot comme sur une colonie) en parallèle de la PCR sur miniprep. Ça vous dira déjà si la différence tient dans la miniprep. Peut être que le signal que vous avez est génomique ? (Vous avez beaucoup de clones positifs ? Peut être que ça recombine)
Vous pouvez aussi séquencer le produit de PCR colonies (c’est toujours sain d’avoir une certitude, surtout en biomol)

[invitee09974cd]

Alooors...
On pensait que cela pouvait être génomique. Mais nous avons testé 3 inserts différents dans 3 plasmides, les 3 donnent un produit de PCR sur colonie (témoin positif sur insert qui confirme, témoin négatif sans ADN qui confirme). Et les 3 perdent leur insert après Miniprep de la culture liquide. Pourtant le plasmide est là (dépôt sur gel de la MiniPrep).

Je me suis dit que cela pouvait provenir de la MiniPrep. Du coup j'ai testé une nouvelle culture liquide sur deux colonies différents: l'une avec un de mes plasmides qui perd l'insert et une autre pour lequel je n'avais pas eu de problème sur un autre kit. Après PCR sur les ADN récupérés de ces cultures liquides, mon plasmide a encore une fois perdu son insert alors que l'autre ne l'a pas perdu...

Alors du coup les différences entre ces deux là...
-Le plasmide est différent ainsi que l'insert. Rejet de la part de ma bactérie d'un insert particulier ? (le plasmide reste présent après Miniprep).
-La souche bactérienne est différente. En effet je travaillais sur des TOP10 avant, et là je suis sur BL21. Problème de BL21 par rapport à ce plasmide/insert ?

Donc... Je vais tester sur la même souche bactérienne. avec mon plasmide/insert bizarre.
Je verrais pour les autres tests. Merci de vos conseils.

[Flyingbike]

Vous avez un contrôle neg de transfo ? Sans insert ou il doit y avoir zéro colonies ?

Et la miniprep sur gel, le plasmide a la bonne taille ? Vous pouvez vérifier vos clones par digestion en plus de la pcr ?

[invitee09974cd]

Oui j'ai fait ce contrôle, il y avait très peu de clones.
Sur gel, le dépot de miniprep me montre que le plasmide est vide. Confirmant la PCR.

C'est peut-être due à l'absence tout simplement de bonne ligation. On me dit que la PCR a peut-être pris en compte des inserts qui seraient parvenus dans les bactéries sans avoir été insérés dans le plasmide...
Je vais tester ça.

[Flyingbike]

l'insert seul n'aurait pas suffit a la survie des bactéries

si elles poussent c'est qu'il y a au moins le plasmide circulaire

mais ce qui est étrange c'est que la PCR donne un signal... vos amorces sont dans l'insert ? vous n'avez pas d'amorces de part et d'autre du site de ligation ? ça serait plus pratique

j'ai pas trop d'idée, a part faire la PCR sur la culture qui sert à la miniprep, en parallèle de la PCR sur la miniprep

Si votre pCR est OK sur les colonies, je ne vois pas comment elle pourrait ne pas l'être sur la miniprep et que vous n'obteniez qu'un plasmide vide...


et en faisant la miniprep direct sur une colonie ? (je ne sais pas si c'est suffisant en matériel)

[invite14397db8]

bête question: vous êtes sûrs que lors de la PCR sur colonie, il n'y a pas de "milieu de ligation" qui se ballade? Genre il y aurait de la préparation contenant le plasmide, avec le plasmide contenant l'insert, qui flotte dans le milieu et donnerait un faux positif en PCR?

[Flyingbike]

Normalement non
Parce que les bactéries ne peuvent pousser qu’en présence de l’insert en principe
Doncc si ça pousse c’est qu’il est dedans

[TanguyE]

Bonjour,

Quand tu dis que le plasmide est présent seul dans la miniprep, sais tu si il est sous forme linéaire ou circularisé par la ligation. (Une digestion avec une seule enzyme devrait donner 2 fragments si il est linéaire). Imaginons que la ligation ne fasse que circulariser le plasmide sans introduire l'insert, ça pourrait conférer la résistance et la PCR positive proviendrait de l'insert qui est transformé en même temps.

[Flyingbike]

dans ce cas (un peu tiré par les cheveux mais pouqruoi pas) il faudrait déposer le produit de ligation sur gel

mais en principe, un morceau d'ADN linéaire ne reste pas longtemps dans les bactéries et est très vite dilué

[invite14397db8]

"J'ai tout de même envoyé à séquencer, et confirmation, mes plasmides ne contiennent plus rien (en tout cas rien ne ressort, je ne trouve plus mon insert)."

C'est à dire? Le plasmide a exactement la même séquence que le plasmide "vide"? Comment la vérification a-t-elle été faite?

[TanguyE]

un peu tiré par les cheveux mais pouqruoi pas

On est bien d'accord, mais la situation est un peu mystèrieuse...

[invitee09974cd]

Bonjour,
Alors pour info, j'ai abandonné l'idée de comprendre pour le moment car je n'ai pas trop le temps.
Mes hypothèses finales:
-Une enzyme de restriction ne coupe pas et j'ai donc des plasmides refermés avec des inserts dans mes colonies ce qui fait que je peux amplifier l'insert, et que je le perd ensuite.
-La bactérie rejette les plasmides avec insert ou celui-ci est toxique. Mais j'en doute, surtout que le gène inséré n'est pas exprimé.

Pour répondre à vos questions:
-Mes oligos sont dans l'insert.
-Pas assez de matériel pour MiniPrep sur colonie.
-PCR colonie, j'ai un contrôle négatif. Donc non pas de faux positif due à du "milieu de ligation"...
-Comment la vérification a-t-elle été faite (séquençage)? Oligos dans le plasmide de part et d'autre de l'insert. Je séquence le plasmide des deux côtés. Plus d'insert.

Je repars avec de nouvelles enzymes et des bactéries différentes.

...

[invitee09974cd]

It works.
Merci tout de même pour vos questionnements.