Béta mercapto

[invite29938131]

Bonjour,
Je suis nouvelle dans ce forum et j'ai une question.
Comment utilise-t-on le Bêta mercapto dans une extraction d'ADN chez les végétaux? Y'a t'il un volume exact à ajouter dans le tube, si oui à quel moment?
Merci d'avance.
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[Flyingbike]

Bonjour et bienvenue


Vous avez un protocole de base ?

Si c'est un kit commercial, tout cela sera précisé

Personnellement je n'ai jamais utilisé de ßME pour de l'ADN

[invite29938131]

Non je ne dispose d'aucun protocole incluant le Beta mercapto malheureusement mais vu son rôle ça me trotte la tête de l'ajouter à mon protocole standard qui n'est pas fameux pour voir la différence.

[Flyingbike]

et quel est votre protocole actuel ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite29938131]

Bah 100mg de matières fraîches à broyer puis ajout de tampon Matab(incubation 20mn)
Ajout de Phénolchloro puis centrifugation
Prélévement du surnageant et ajout d'Isoprop à froid puis centrifugation
Déverser le liquide et avec le culot obtenu ajouter de l'éthanol pour laver d'où une dernière centrifugation.
Sécher le culot et ajouter du TE pour la conservation. Ce qui mer fin à l'extraction.

[Flyingbike]

et qu'est ce qui e va pas, actuellement ?

[invite29938131]

Mon ADN est "merdique" à cause des protéines qui le saturent d'où mon envie d'utiliser le béta mercapto pour casser les ponts disulfures et espérer avoir un meilleur résultat. Comment et à quel moment reste mon mystère

[Flyingbike]

quel est le volume de tampon que vous ajoutez au début ? c'est quoi d'ailleurs ce tampon ?

et le volume de phénol/chlo ?


les protéines, vous les suspectez a cause d'un signal à 280nm ?


sinon, pour le ßME, je le mettrais au début dans le premier tampon, à raison de 10µL/mL

[invite29938131]

750ul de tampon Matab et 750ul de Phénolchloro

[Flyingbike]

et votre surnageant de phénolchlo est clair ?

[invite29938131]

Oui très limpide

[Flyingbike]

les protéines, vous les suspectez a cause d'un signal à 280nm ?

?


autre idée, si vous avez suffisamment d'ADN, c'est de refaire une étape de phenol/chlo après avoir récupéré la phase aqueuse, 1 volume : 1 volume

[invite29938131]

Oui j'y ai pensé aussi et mm déjà fait mais ça change rien

[Flyingbike]

vous pouvez aussi chauffer avant de faire le phénol chloroforme histoire de dénaturer un peu


vous ne m'avez pas répondu, cette histoire de protéines, comment vous savez ?

[invite29938131]

Chauffer le matériel ou le phénolchloro.
Parce que quand je le reprend dans du TE le culot a du mal à se dissoudre, on y observe mm des éléments blanchâtres.

[Flyingbike]

Chauffer dans le premier tampon après broyage (il y a quoi dans ce tampon ?)

Je ne suis pas convaincu par les protéines. Vous avez fait un spectre ? Il ressemble à quoi ?

Pour l’éthanol de la fin, c’est du 70% ?