[exo][BiologieMoléculaire]ligase/sites de restriction

[jojolafanfreluche]

Bonjour à tous,
Je suis un peu perdue sur un exercice de biologie moléculaire/ génie génétique. On étudie deux sites de restriction très classiques : bamHI et PstI. Je bloque sur les questions c,d et e, où on nous demande s'il est possible de recoller les extrémités de chaque site de restriction à l'aide de ligase. Instinctivement, j'aurais dit oui, du temps qu'on a des extrémités cohésives compatibles. Cependant, les questions c et d sont posées de telles sorte que j'ai l'impression que la réponse est différente selon le site de restriction. Auriez-vous des pistes pour répondre à ce genre de questions?
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[Flyingbike]

la réponse à c) dépend de votre réponse à b). En réalité, la réponse à b) est un peu technique car pour BamHI on obtient un 3' overhang, pour PstI c'est un 5' overhang.

Qu'avez vous répondu en b) ?

[jojolafanfreluche]

Bonjour et merci pour votre réponse,
Pour la question 2, je pensais que notre échantillon de nucléotides serait amplifié, dans la mesure où les dNTP, l'ADN Polymerase (si c'est une Taq polymerase), et le MgCl2 sont utilisés pour faire une PCR. Cependant, il manque alors les amorces.
Je vous avoue que vous me faites découvrir le terme d'overhang, que je n'ai jamais étudié en cours.

[Flyingbike]

Hello

overhang est le terme utilisé pour dire que les deux brins ne sont pas coupés à la même position, et donc qu'il y a une portion d'un des brins qui "dépasse"


En réalité, dans ces conditions expérimentales, on ne va rien amplifier, la polymérase va soit boucher le trou, soit manger ce qui dépasse, en fonction de différents paramètres. Je vous laisse réfléchir dans quel sens peut travailler la DNA polymérase

[A voir en vidéo sur Futura]

[jojolafanfreluche]

Au temps pour moi, on a bien vu en cours la notion d'overhang mais sous un autre nom : on a simplement parlé d'extrémités franches et d'extrémités cohésives dans le cas où l'un des fragment est plus long que l'autre.
Peut-être que la polymérase sert à créer le brin complémentaire de la séquence (type réplication)?

[jojolafanfreluche]

Par hasard, j'ai trouvé un autre exercice du dunod qui m'a orienté pour celui-ci. Voilà donc ce que j'en ai conclu : la polymérase va allonger les brins, mais pour cela, elle a besoin d'une extrémité 3'OH libre. C'est le cas pour BamHI mais pas PstI. Ainsi, les extrémités de BamHI pourront être recollés (puisqu'elles n'auront pas pu être modifiées), tandis que ce ne sera pas possible pour PstI, dont les extrémités ne sont plus compatibles.

[Flyingbike]

Vous avez bien compris le concept. Cependant votre exercice est très peu clair et très ambigu.

On pourrait très bien "recoller" des morceaux une fois les trous bouchés. Une ligase fonctionne aussi sur des extrémités franches !