UPLC - petites questions de compréhension pour défense de mémoire

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Bonjour à tous,

Dans le cadre de mon mémoire en sciences biomédicales, j'ai mis au point une méthode dosant la prednisolone en UPLC, en faisant une extraction liquide-liquide à partir de sérum spiké.

Je prépare actuellement la défense de ce mémoire, et j'ai quelques petites questions pour lesquelles je ne trouve pas de réponse dans les bouquins de référence... Pourriez-vous m'aider ? Un tout tout grand merci !

* Quels sont les avantages d'une extraction liquide-liquide par rapport à une SPE ? J'aurais tendance à dire que la SPE est plus chère ?

* Le critère principale d'un solvant d'extraction, c'est bien que l'analyte d'intérêt y soit soluble ?

* Quels doivent être les critères du solvant de reconstitution ? Une composition proche de la phase mobile ?

* Quels pourraient être les causes d'un dédoublement de pic ? Des impuretés ? Une phase mobile non adaptée ? Pourquoi est-ce cela apparait plus souvent aux basses concentrations qu'aux concentrations élevées ?

* L'influence de la température, c'est bien le changement de viscosité de la phase mobile ? Et donc, au plus la température augmente, au plus le débit sera augmenté sans augmentation de pression ?

* L'influence de la pression, c'est bien un changement de débit ? Mais il existe sans doute une pression idéale, au dessus de laquelle l'augmentation de débit n'est plus possible/pas bénéfique ?

*Pourrait-il y avoir une accumulation d'échantillons à doser si le temps d'analyse est trop court, et est-ce que cela pourrait mener à des changements de temps de rétention ?
Et donc, dans ce sens, c'est bien utile de laisser l'UPLC touner quelques minutes simplement avec la phase mobile afin de retourner aux conditions initiales ?

*Par rapport à la colonne, une colonne HPLC peut être utilisée en UPLC mais pas l'inverse, c'est juste ? Si une colonne UPLC est mise dans une HPLC, les pressions seraient bcp plus élevées ?

*Concernant la phase stationnaire en UPLC, j'utilise une colonne silice greffée C18. On est bien d'accord que la principale différence entre cette colonne et une colonne silice greffée mais HPLC, c'est la taille des particules de silice qui sont plus petites en UPLC ?

*La longueur de la colonne a une influence également ? Plus elle est petite, plus les temps d'analyse seront rapides ?


*En phase inverse, si le composé A sort après le composé B, cela signifie que le composé B est plus polaire que le A ?

*Si je pars du rapport 55%MeOH/45%eau, et que je passe à un rapport contenant plus de méthanol, ma phase mobile sera donc moins polaire, et les composés sortiront plus tard ?

*Si je remplace le MeOH par de l'acétonitrile, vu que celle ci est moins polaire, là encore mes composés sortiront plus tard ?

*Le frond de solvant, cela correspond à quoi réellement ? Difficile de trouver des informations claires à ce sujet

*Concernant les détecteurs, l'UPLC que j'utilise est couplée à un détecteur à barrettes de diodes. Est-ce que ce détecteur est plus ou moins sensible que la fluorescence ? Quels sont ses avantages ?



Un tout tout grand merci.
Ce sont des petits détails, mais qui me seront très utiles pour la défense orale de mon travail.
J'ai du mal à imaginer le style de questions qu'ils peuvent me poser, donc j'imagine tout et n'importe quoi

Merci beaucoup d'avance,

Eva, une étudiante un peu perdue, et surtout stressée
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[invite9ad979a3]

* Quels sont les avantages d'une extraction liquide-liquide par rapport à une SPE ? J'aurais tendance à dire que la SPE est plus chère ? N est ce pas un meilleur rendement d’extraction ??


* Le critère principale d'un solvant d'extraction, c'est bien que l'analyte d'intérêt y soit soluble ? Oui c’est mieux

* Quels doivent être les critères du solvant de reconstitution ? Une composition proche de la phase mobile ? Il est d’intérêt de ne pas injecter qqle chose non miscible avec la phase mobile

* Quels pourraient être les causes d'un dédoublement de pic ? Des impuretés ? Une phase mobile non adaptée ? Pourquoi est-ce cela apparait plus souvent aux basses concentrations qu'aux concentrations élevées ? La présence d’un pic sous un autre est envisageable.

* L'influence de la température, c'est bien le changement de viscosité de la phase mobile ? Et donc, au plus la température augmente, au plus le débit sera augmenté sans augmentation de pression ? Avec une augmentation de la Température, on perd en Pression. Tes pas forcé d’augmenter pour autant le debit. De plus, la temperature permet souvent une meilleur diffusion de l’analyte dans la colonne et permet de gagner en symetrie (peak shape)

* L'influence de la pression, c'est bien un changement de débit ? Mais il existe sans doute une pression idéale, au dessus de laquelle l'augmentation de débit n'est plus possible/pas bénéfique ? Pas nécessairement à cause d’un changement de débit. En effet pour une même colonne (même longueur/diamètre) mais de taille de particule differentes, la pression sera pas la meme. Petite particule (1.8 µm en UPLC) grosse pression à l’inverse 5 µm en HPLC, faible pression.
Pour ce qui concerne le débit optimum il existe une relation entre l’efficacité de la colonne (Hauteur de plateaux theorique) et la velocite (débit). Tous est facilment comprehensible avec la Fameuse courbe de Van deemter que je t’invite à consulter et à bien comprendre.

*Pourrait-il y avoir une accumulation d'échantillons à doser si le temps d'analyse est trop court, et est-ce que cela pourrait mener à des changements de temps de rétention ?
Et donc, dans ce sens, c'est bien utile de laisser l'UPLC touner quelques minutes simplement avec la phase mobile afin de retourner aux conditions initiales ? Il y a toujours un risque d’effet mémoire dans le cas de concentration élévée. Il est donc interessant d’injecter des blancs pour verifier cet effet mémoire.

*Par rapport à la colonne, une colonne HPLC peut être utilisée en UPLC mais pas l'inverse, c'est juste ? Si une colonne UPLC est mise dans une HPLC, les pressions seraient bcp plus élevées ? Ce qu’il fait UPLC c’est je pense le diamètre interne de la colonne et le diamètre des particules. De plus en UPLC, on est dans le cas de micro pompe qui délivre des débits de 1 ml/min soit mais le plus souvent à des débits optimum (selon la courbe Van deemter) autour de 0.1à 0.3 ml/min. Donc mettre une colonne HPLC sur UPLC na vrament aucun interet, et comme tu la dis une colonne UPLC sur HPLC nest pas vraiment possible en raison des fortes pressions


*Concernant la phase stationnaire en UPLC, j'utilise une colonne silice greffée C18. On est bien d'accord que la principale différence entre cette colonne et une colonne silice greffée mais HPLC, c'est la taille des particules de silice qui sont plus petites en UPLC ? Exacte

*La longueur de la colonne a une influence également ? Plus elle est petite, plus les temps d'analyse seront rapides ? Cest souvent vrai d’autant qu’une petite colonne engendre de plus grosse pression qu’une grande colonne, d’où des petits débits aussi.


*En phase inverse, si le composé A sort après le composé B, cela signifie que le composé B est plus polaire que le A ? pas necessairement, certaine technologie de colonne comme les colonnes HILICs reposent sur l’effet inverse pourtant on est toujours dans le cas HPLC inverse

*Si je pars du rapport 55%MeOH/45%eau, et que je passe à un rapport contenant plus de méthanol, ma phase mobile sera donc moins polaire, et les composés sortiront plus tard ? Pareil tout dépendant de la colonne. Dans un schéma classique, plus on a de phase orga plus les composés polaires auront tendance à sortir vite. N’oublie pas que la polarité est un facteur mais le coefficient de partage aqueux/organique aussi.

*Si je remplace le MeOH par de l'acétonitrile, vu que celle ci est moins polaire, là encore mes composés sortiront plus tard ? pas forcement

*Le frond de solvant, cela correspond à quoi réellement ? Difficile de trouver des informations claires à ce sujet . Correspond au pic injection. Plus flagrant si ton diluant est different de ta phase mobile

*/Concernant les détecteurs, l'UPLC que j'utilise est couplée à un détecteur à barrettes de diodes. Est-ce que ce détecteur est plus ou moins sensible que la fluorescence ? Quels sont ses avantages ? Disons que la fluo est spécifique. Si ta derivation fonctionne bien, on est aussi performant que de l’uv.

[invitecfe9a2d6]

Merci beaucoup pour ces précisions !
Si j'ai d'autres questions, je posterai à nouveau

Si vous avez des idées de questions qui pourraient venir à ma défense, sachant que le thème principal de mon mémoire est "le développement et la validation d'une méthode de dosage en UPLC de la prednisolone dans le cadre des transplantations rénales", c'est évidemment bienvenu

Merci encore !

Eva

[invitecfe9a2d6]

Re-bonjour, ou plutôt bonsoir,

Je viens de me souvenir que dans les 3-4 questions d'"exemple" posées par ma promotrice, il y avait celle-ci :

Quelle est l'impact/l'importance de la colonne en UPLC par rapport à l'importance de celle-ci en LC-MS/MS.

J'aurais tendance à dire que la colonne est bien plus importance en HPLC, car c'est ce qui sort qui sera directement analysé.
En LC-MS/MS l'importance de la colonne est moindre car ce qui sort de la colonne peut encore être dévié si on connait le PM de l'analyte d'intéret....

Mais j'ai l'impression de m'embrouiller

Merci beaucoup pour votre aide !

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite9ad979a3]

Salut

Je ne comprend pas trop le sens de ta phrase...la question est la comparaison entre l utilisation de l HPLC et UPLC en masse ??

Et si ce nest pas top secret je peux envoyer mon adresse mail en MP et tu pourra m envoyer ton rapport pour lecture.

Alex

[invitecfe9a2d6]

Oui, elle voulait comparer l'importance de la colonne en HPLC et en LC-MS/MS !
Tu peux m'envoyer ton mail en MP, je te filerai mon rapport

Merci