Augmentation de l'aire des pics au fil du temps

[Floppyto]

Bonjour à tous,

Je poste ce premier message sur le forum, car malgré de nombreuses recherches sur le net , je n'ai pas trouvé de réponse à mon problème.

Le problème est le suivant : Je travaille sur un appareil HPLC shimadzu avec détection UV sur une analyse de quantification d'un composé uniquement ( donc pas de séparation). L'analyse est des plus basiques, c'est un mode isocratique avec comme solvant du methanol pur et sans ISTD.

J'ai remarqué récemment que lors de chaque analyse, l'aire de mes pics augmente au fur et à mesure que l'analyse avance. J'ai donc préparé 10 échantillons du même standard, que j'ai injecté 3x chacun afin de voir si l'aire des pics se stabilisait au bout d'un moment. A la fin de l'injection des 30 échantillons, l'aire ne semble pas s'être stabilisée. Au début et à la fin de la séquence, j'ai mis des blancs ( methanol pur ) afin de voir s'il y avait une quelconque contamination. Le résultat est sans appel, les blancs sont parfaits.

Je vous ai joint une image du fichier excel où j'ai relevé l'aire en fonction de l'heure de l'analyse et fait un graphe de ces valeurs afin de mieux illustrer mes dires.

N'étant pas un grand expert dans le domaine de l'HPLC, je voudrais savoir si quelqu'un a déjà rencontré un problème similaire ou si vous avez des idées de la nature de mon problème.

Merci d'avance pour votre aide
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[vpharmaco]

Regarder peut-être du côté de la température du système/cellule UV au cours de la série de mesures ? (même si les variations observées me semblent énormes pour que cela ne viennent que de là) http://www.shimadzu.com/an/hplc/supp.../43/43tec.html

[Floppyto]

Bonjour vpharmaco,

Tout d'abord merci de ta réponse.

Pour ce qui est de la température du four et de la cellule, les deux sont en permanence à 35°C. Je ne l'ai pas précisé dans mon message mais le volume d'injection est de 100uL, ce qui est , semble t'il, beaucoup. Est-ce que cela pourrait avoir une quelconque influence ?

[vpharmaco]

100 uL pour une colonne de quelle taille/granulométrie, à quel débit ?
Oui, cela m'a l'air beaucoup effectivement pour de l'analyse HPLC.

[A voir en vidéo sur Futura]

[Floppyto]

Voici les specs de la colonne :

% Carbon Load: 18

French Brand: ACQUITY UPLC

French Chemistry: C18

Endcapped: Yes

Endfitting Type: Parker-style

French Format: Column

French ID: 3 mm

French Length (mm): 100 mm

French Mode: Reversed-Phase

Particle Shape: Spherical

French Particle Size (dp): 1.7 µm

Particle Substrate: Hybrid

Pore Size: 130Å

Silanol Activity: Low

Surface Area: 185

System: UPLC/UHPLC

Technology: BEH

USP Classification: L1

Units in Package: 1/pkg

pH Range 1 - 12

Pour ce qui est du débit , il est de 0.600mL/min.

[vpharmaco]

C'est une colonne qui doit avoir un volume de colonne d'environ 500-800uL. Idéalement, il faut que le volume d'injection ne dépasse pas 1-5% du volume de colonne... mais je ne pense pas que cela vienne de là (le risque c'est que le produit sorte dans le pic d'injection, mais tu l'aurais vu en UV)

[vpharmaco]

Autre option, vu que c'est l'été...
soleil, labo non-climatisé, échantillon dans un solvant volatile, vial sans septum -> évaporation du solvant au cours de la journée ??

[Floppyto]

Non, ca ne doit pas venir de là, le labo est climatisé, le soleil n'y entre pas et les échantillons sont dans un compartiment réfrigéré. Le solvant utilisé est du methanol. J'ai lancé une séquence en mettant un blanc tous les 5 échantillons, il n'y a pas de contamination et l'aire ne redescend pas après le blanc, au contraire. Petit apercu ci-dessous.

J'ai relancé une 30aine d'injection avec un blanc tous les 5 injections afin de voir comment varie mon aire. Dès que j'ai les résultats je les partagerai.

Merci de ton aide