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questions PCR



  1. #1
    missnanou

    questions PCR


    ------

    Bonjour,
    Voici une serie de questions et exercice auxquelles j'ai répondu.
    Je souhaiterai obtenir vos avis.

    A-Quelles sont les 3 actions que vous pouvez entreprendre pour améliorer une PCR si:

    a) l'amplification donne trop de bandes:
    1- j'augmente le TM pour diminuer les hybridations aspécifiques
    2-je diminue la concentration en Mg2+ car ces ions facilitent l'hybridation aussi bien spécifique qu'aspécifique
    3-je diminue le nombre de cycles car au bout d'un certain la taq polymérase peut s'épuiser et ainsi faire des erreurs qui se traduisent souvent par des hybridations aspécifiques


    b) l'amplification est trop faible:
    1-j'augmente le nombre de cycles
    2-j'augmente la quantité de matrice (ADN)
    3-J'augmente la concentration en Mg2+


    B- Vous souhaitez obtenir la sequence sur les 2 brins d'un fragment PCR préalablement amplifié et cloné dans un plasmide.
    Vous avez à votre disposition les 2 amorces (A et B) ayant permis l'amplification du fragment, une solution de mélange de séquençage (dNTP, ddNTP), de la taq polymérase, du plasmide recombinant.
    Enumérez les produits à mélanger pour parvenir à vos fins:

    Mix 1: amorce A, mélange dNTP, ddNTP, taq, plasmide recombinant, tampon 10X, mg2+,
    Mix 2 : amorce B, mélange dNTP, ddNTP, taq, plasmide recombinant, tampon 10X, Mg2+


    C- Pour étudier son polymorphisme, vous devez amplifier par PCR la même séquence portée par un plasmide bactérien et contenue sur de l'ADN génomique humain. Parce que vous etes préssés, vous effectuez des préparations rapides d'ADN total à partir d'une suspension bactérienne et de cellule humaines en culture. Vous réalisez la PCR (25 cycles) puis faites migrer le mélange réactionnel sur gel d'agarose. Après coloration au BET et observation sous UV, vous observez une bande sur la piste préparation bactérienne et rien dans la piste préparation humaine.
    Donnez les raisons possibles. Quels seraient les paramètres à modofier pour avoir une bande sur les 2 pistes?

    Je ne vois pas pourquoi le résultat est différent.
    Peut-etre qu'il faudrait faire une nested-PCR sur la préparation humaine pour mieux cibler la zone à amplifier.
    Si j'étais confronter à ce résultat je recommencerai une manip avec ces mêmes amorce et avec d'autre amorces qui amplifie un autre frangment.
    Mais je ne pense pas etre sur la bonne piste !


    D-Lors du dosage d'un extrait d'ADN au spectro, que permettent de mesurer:
    a) la DO 260 : dosage acides nucléique
    b) la DO 280 : dosage protéines
    c) le rapport DO260/DO280 : qualité de la solution d'ADN
    d) la DO 270 : dosage phénol
    Que devez vous faire préalablement à la mesure de l'échantillon d'ADN : [COLOR="blue"]une dilution de ma solution mère, un blanc constitué du diluant.

    Je remercie toutes les personnes qui aurant pris le temps de lire et de corriger ces excercices.
    Nanou

    -----

  2. #2
    missnanou

    Re : questions PCR

    Bonjour,
    Je me permet de faire remonter ce message.
    Merci

  3. #3
    LXR

    Re : questions PCR

    Bonjour,

    A) Dans la mesure du possible, tester un ou plusieurs autres couples de primers peut s'avérér efficace dans les deux cas.

    B) OK, mais dans les tampons commerciaux on y trouve tout généralement donc pas besoin d'ajouter du Mg2+.

    C) Le fait qu'il n'y ait rien dans la piste humaine alors que dans la piste bactérie on retrouve une bande provient certainement du fait que la région à amplifier est en grand nombre de copies dans les bactéries alors qu'elle n'est qu'en deux copies ou une seule copie s'il y a un polymorphisme allélique, dans les cellules humaines. La meilleure des solutions consiste en effet à faire une nested-PCR qui permettra d'augmenter la spécificité des PCR au fur et à mesure, ainsi que d'augmenter le nombre de matrice initiale et donc d'amplicons.

    D) OK, le rapport, on considère que le rapport 260/280 doit être supérieur ou égal à 2.

    Greg

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