Déterminer longueur d'un ADN ?

[Hellbly]

Bonjour à tous, je suis en licence Biocell&Physio et je bloque un peu sur l'un de mes TDs de Biologie Moléculaire, j'aurai donc besoin de vos lumières....

On mesure l'absorption à 260nm (A₂₆₀) d'une solution d'ADN chromosomique d'E.coli purifié double brin à l'aide d'un spectrophotomètre.
On obtient une absorption A₂₆₀=3.
Après dilution au 10^ème on obtient une A₂₆₀=0,6
A cette dilution, le rapport A₂₆₀/A₂₈₀=0,8

1. Pourquoi mesure t-on l'absorption à 260nm ? Quelle indication donne le rapport A₂₆₀/A₂₈₀ ?

- A₂₆₀ car les bases azotées absorbent dans ce spectre (contrairement aux protéines qui sont à 280nm).
- Le rapport A₂₆₀/A₂₈₀ indique la "qualité" de la fraction d'ADN étudiée. La valeur de ce rapport doit être supérieure à 1,8. Or ici elle vaut 0,8.
On peut en conclure que la solution_1/10 d'ADN n'est peut-être pas assez purifiée ? Ou trop diluée (mais malgré la dilution, le rapport ne devrait pas évoluer non ?)

2. Quelle valeur faut-il utiliser pour déterminer la concentration de la solution X ?

- On choisira la valeur A₂₆₀=3, plus précise que celle de la solution_1/10

3. Quelle est cette concentration avec A₂₆₀=1 correspondant à 50μg/ml^-1 pour cet ADNdb ?

- A₂₆₀=3, donc 3 x 50 = 150μg/ml^-1

4. Quelle est la longueur en nm de l'ADN chromosomique d'E.coli sachant que sa masse molaire est de 2,6.10⁹g.mol^-1, lorsqu'il est sous forme d'hélice B.

- donc...

2,6.10⁹ / 330 ~ 7,8.10⁶ nucléotides
7,8.10⁶ / 10,4 ~ 7,5.10⁵ tours
7,5.10⁵ x 3,4 ~ 2,6.10⁶ nm

soit l_ADN ~ 2,6 mm

Ai-je bon ?

Merci d'avance, cordialement,
Raph.

infos supplémentaires : 1 tour d'hélice d'un ADN forme B est de 3.4nm et contient 10.4pb par tour. On considèrera que la masse molaire d'une nucléotide est en moyenne de 330g/mol^-1.
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[piwi]

4. Quelle est la longueur en nm de l'ADN chromosomique d'E.coli sachant que sa masse molaire est de 2,6.109g.mol-1, lorsqu'il est sous forme d'hélice B.

- donc...

2,6.109 / 330 ~ 7,8.106 nucléotides
7,8.106 / 10,4 ~ 7,5.105 tours
7,5.105 x 3,4 ~ 2,6.106 nm

soit lADN ~ 2,6 mm

Ai-je bon ?

N'oubliez pas que l'ADN est double brin. Ce n'est pas une seule chaine de nucléotides mais deux enroulées sur elles mêmes.

Sinon, une DO de 3 est une DO très élevée. Trop élevée en fait. Au delà de 1, grosso modo, l'accroissement de la DO n'est plus proportionnel à la concentration. La mesure est très imprécise.

Cordialement,
piwi

[Hellbly]

Ah oui....je m'en souviens maintenant. A chaque TP on nous le répète qu'il ne faut pas utiliser les DO > 1, j'ai encore oublié....

du coup, la concentration est :

c= 0,6x50 soit 30μg/ml^-1

et la longueur :

l = 2,6 x 2 = 5,2mm

Merci beaucoup !

Raph.

[piwi]

et la longueur :

l = 2,6 x 2 = 5,2mm

Merci beaucoup !

Toujours pas. En fait si vous avez n nucléotides vous avez n/2 paires de bases. Et les tours d'hélices se font avec les paires de bases. Donc il faut diviser par deux votre premier résultat plutôt que le multiplier par deux.

Cordialement,
piwi

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