Amplification par PCR

[droitObut]

Bonjours à tous, j'ai besoin d'aide pour un petit exercice, si quelqu'un pouvait m'aidé à commençer, Merci d'avance!

Voilà l'énoncé:
Dessiner les amorces sens et reverse qui permettront d’amplifier par PCR le gène
DVU0695 ci-dessous.
GTGGCACTGCTTACATTCCATGCCAGCATC ATTGACATGGACCTTGTGGCTGAAC
CGGATCGGCTGTTCTTTCTGGCTGTAGAGC ATTTCCGGGAATGCCCACCAACCGA
AGACCAGCGCGACGACCAGGCCGACGAAGA ACGGCGCTGCGCCACCACATGCGC
ATTTGCGACCGTTTTCGTTGTCTGCATTGG TTAA

[stonekiller]

Ce n'est vraiment pas compliqué si tu as compris le principe d'une PCR, désolé mais t'aider plus que ca sans faire l'exercice, c'est impossible!
Revoie étape par étape en quoi consiste la PCR tu comprendras très vite

En revanche si certaine étapes t'échappe n'hésite pas à nus en faire part!

[droitObut]

Bien sûre ce serait inutile de me faire l'exercice! je pensais à :

Pour l'amorce up: XXXXCACCGT et pour la down: XXXXAATTGG


Mais faut-il que l'amorce commence uniquement à l'ATG jusqu'au STOP ou bien comme j'ai fait?



Merci de votre aide!

[stonekiller]

Que signifie ton x (il n'existe pas dans le code international). Si tu cherches juste à amplifier ton gène, il est inutile de commence ton dessin d'amorce par un ATG et de même il n'est pas nécessaire de finir par un stop. Apres évidement si tu souhaites les utiliser sur ADNc la oui il vaut mieux qu'ils soient fait sur la phase codante!

[droitObut]

En fait à la place des X, ce sont des nucléotides, peut importe lesquels du moment qu'il ne sont pas complémentaire d'une partie de ma sequence, qu'en pensez-vous?

[404BlueJack]

J'ai le même problème que lui et je ne sais pas trouvé des amorces.
La procédure qu'on a nous dit pas comment faire.

[piwi]

Un petit dessin valant mieux qu'un long discours, en voici un.
Les couleurs soutenues (rouges et vertes représentent les amorces). La convention veut que l'on ne décrive une séquence d'ADN qu'en n'explicitant que le brin 5'-3'.
Ceci étant dit. Si l'amorce sens est complémentaire au brin 3'-5', alors que peut on dire de sa séquence par rapport au brin 5'-3'? Une fois ceci bien compris, comment trouver l'amorce reverse grâce au seul brin 5'-3'?

5' -------------------------->3'
3'<---------------------------5'

5' -------------------------->3'
--- <---------------- <----


--- ---->----------------->
3'<---------------------------5'

Par ailleurs, Pourquoi voulez vous créer des amorces qui ne soient pas entièrement spécifiques du fragment d'ADN que vous souhaitez amplifier? La probabilité de rencontrer une base est de 1/4, celle de rencontrer deux bases précises est de 1/4; 3 bases, 1/8 etc... Quelle est la probabilité de rencontrer 6 bases? Est-ce fréquent dans un génome de 3.10⁹ pb? La longueur d'identité de vos amorces par rapport au fragment cible n'est elle pas un moyen d'augmenter la spécificité d'amplification?

Cordialement,
piwi

[droitObut]

"La convention veut que l'on ne décrive une séquence d'ADN qu'en n'explicitant que le brin 5'-3'.
Ceci étant dit. Si l'amorce sens est complémentaire au brin 3'-5', alors que peut on dire de sa séquence par rapport au brin 5'-3'? Une fois ceci bien compris, comment trouver l'amorce reverse grâce au seul brin 5'-3'? "


L'amorce sens sera donc identique au brin 5'-3', et pour l'amorce reverse je bloque un peu...

Quant à la longueur des amorces on peut les choisir aussi longues que l'on veut pour augmenter la spécificité donc.

[droitObut]

UP svp c'est très important

[stonekiller]

Regarde cette animation elle bien faite:

http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/pri...esentation.htm

n'oublie pas que la taq amplifie de 5' vers 3'. Je te conseil de dessiner étape par étape ce qui se passe lors de la réaction PCR ca t'aidera vraiment à comprendre le principe.

[droitObut]

ok (pas mal l'animation)

je dirais, pour l'amorce up: 5'GTGGCAC3'
et pour la down: 5'AATTGG3'

(en les prenant plus longues pour augmenter la spécificité)

[stonekiller]

Mais en réalité les primers sont généralement bien plus long que ca ! (20 pb en moyenne)