Migration Western Blot

[ratafouin]

Bonjour à tous.

Depuis quelques temps, mes migrations de western blot sont moches.
Le front de migration n'est pas net (plus une sorte de flou bleu qu'une bande), et les protéines ne se séparent pas bien. En Coomassie le bas du gel ne présent pas de belles bandes discrètes. Pourtant le marqueur lui migre très bien.

J'ai refais les tampon de migration 2 fois ainsi que le tampon d'échantillon.
Je travail avec des bactéries E.coli directement reprisent dans le tampon de charge et bouillit 5 minutes avant dépôt.

Merci d'avance
Ratafouin
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[invitec718404f]

La compo de ton gel SDS?

[ratafouin]

Bonsoir et merci de ton attention.

Alors le gel de séparation c'est pour 10 ml :
3 ml (12%) ou 2.5 ml (10%) acrylamide bis (base de 37,5:1 de chez BIORAD)
2.5 ml Tris-HCl pH8.8 1.5M
100 µl 10% SDS
qsp 10 ml H20
100 µl APS 10%
10 µl Temed

Pour le gel de concentration pour 5 ml :
0.5 ml (4%) acrylamide bis (même base qu'avant)
1 ml Tris-HCl pH6.8 0.5M
50 µl 10% SDS
qsp 5 ml H20
50µl APS 10%
5µl TEMED

Comme dit précédemment le marqueur de poids moléculaire migre tout à fait normalement.
Pour le tampon d'échantillon j'utilise pour 10 ml
2.5 ml Tris-HCl pH6.8 (le même que pour les gels)
2 ml SDS 10%
2ml Glycérol
0.5 ml Bmercapto
0.01% bleu de bromophénol
qsp 10 ml H20

[invitec718404f]

Rien ne semble abérant à mon avis ton souci est au niveau de ton tampon de charge. Tu aurais possibilité d'essayer un laemni de chez Biorad pour comparer?

[A voir en vidéo sur Futura]

[ratafouin]

Je vais essayé de me procurer un autre tampon d'échantillon voir ce que ça donne...

[invitedeb0206a]

Ce genre de soucis m'est arrivé plusieurs fois lorsqu'il y a une fuite de tampon entre les deux compartiment de la cuve d’électrophorèse, ce qui provoque un mauvais passage du courant, donc les protéines migrent mal donc sont mal séparées et diffusent dans le gel, ce qui provoque le "flou". vérifiez les joins d'étanchéité, sinon il suffit de rajouter du tampon dans le compartiment interne en faisant attention à ce que les milieux "externes" et "internes" n'entre pas en contacte.

[ratafouin]

Je viens de refaire un gel ce matin pour tester.
Le soucis semble persister même sans fuite dans les cuves de migration.

Je n'ai pas trouver de tampon de charge commercial, j'ai testé celui que j'ai préparé récemment avec d'autre qui marchait avant.

J'ai bien une bande qui se forme au moment ou le bleu atteint la limite entre gel du haut et gel du bas mais après ce passage ça redevient une épaisse bande flou...

[invitec718404f]

Oui mais apparemment le marqueur reste pas mal.

[ananda]

Je viens de refaire un gel ce matin pour tester.

Le soucis semble persister même sans fuite dans les cuves de migration.


Je n'ai pas trouver de tampon de charge commercial, j'ai testé celui que j'ai préparé récemment avec d'autre qui marchait avant.

J'ai bien une bande qui se forme au moment ou le bleu atteint la limite entre gel du haut et gel du bas mais après ce passage ça redevient une épaisse bande flou...

Bonjour !

Peut-être que tu charges trop de protéines ? Le fait que le profil de migration du marqueur moléculaire soit OK indique que le pb vient de tes échantillons --->vérifier donc le tampon de charge (il semblait marcher avant) et ton matériel initial...tu resuspends combien de culot de bactérie ? Essaie avec moins. Sinon je te salue par la pensée pour ton travail dans un labo un samedi matin !

[invitec718404f]

Ah oui c'est une bonne idée! Tu charges combien en unités DO?

Je fais souvent des SDS PAGE sur E coli aussi et je charge entre 0.1 et 0.15 uDO.

[ratafouin]

En unité DO sur gel ça fait du 0,1.
J'ai essayé aussi avec de la BSA purifiée à raison de 30 microgrammes
J'ai essayé aussi avec des mitochondries de levure purifiées en déposant 50 microgrammes. Idem avec des extrait totaux.

Même avec du tampon de charge seul ça ne migre pas normalement.

Je viens de refaire un gel avec des tampons d'une collègue ainsi que son tampon de charge qui fonctionnent très bien ensemble. Mais visiblement dans mes mains non. J'ai toujours un front de migration flou et des bandes de protéines pas très nettes... *PAN*

Vous pensez que ça peut venir du Tris-Glycine? C'est le seul truc que j'ai pas encore changer ainsi que la cuve de migration...

[ananda]

Euh...ça paraît complexe ! Essaie avec les solutions (pour faire le gel) et le tampon de charge de ta collègue...avec une cuve électro de ta collègue...Et prie !

[invitec718404f]

En unité DO sur gel ça fait du 0,1

Alors ce n'est pas un souci de quantité.

[ratafouin]

J'ai pensé aussi aller brûler un cierge...
J'ai la poisse sur plein de truc comme ça, c'est déprimant à force...
Mais bon un jour ça va finir par marcher je me dis

[Flyingbike]

vérifies les pH de tes tampons (migration et loading)

[ratafouin]

Déjà fait. J'ai même refait les tampons. De plus ce de ma collègue (dont je nai pas vérifié les pH) fonctionne avec elle).

Pour le tampon de concentration je suis à pH6,78 à 10° et pour le tampon de séparation je suis à pH8,84 à 10°
Le loading dye est fait à partir du tampon de concentration donc le même pH en théorie...

Je vais voir pour le tris-Glycine à quel pH il est...

[ratafouin]

J'ai vérifié le pH du tris Glycine il est à 8,5 ce qui semble normal...

[invitec718404f]

Moi j'utilise le même pH.

[invitef5962f47]

Tu as essayé de faire migrer moins vite le gel ?

Tu as bien un changement de couleur du tampon de chargement après les 5 min a 95 degrés et tu centrifuges bien tes échantillons après les avoir fait bouillir ?

[invitec718404f]

Moi ce que je fais: je centrifuge 1 uDO que je reprends ensuite dans 100µL d'eau et je prélève 10µL que je met avec mon tampon à 95°C 5 min.

[ratafouin]

Bon ba j'ai refait deux gels ce matins.
J'ai changé le tampon de migration ainsi que la cuve et le problème de migration persiste...

Si quelqu'un a une illumination je suis preneur...

[Flyingbike]

une photo ?

[invitec718404f]

Et tu as changé le tampon de charge?

[ratafouin]

Les gels ont déjà été transférés donc trop tard pour la photo.

J'ai testé différents tampons de charge dont un "fait maison" qui marche chez ma collègue et ça n'a rien changé.

En générale je migre à 130V 90 minutes mais en migrant moins vite la migration garde le même aspect...

[invitec718404f]

En générale je migre à 130V 90 minutes mais en migrant moins vite la migration garde le même aspect...

Et plus vite? Moi je fais du 220V...

[ratafouin]

J'ai pas essayé plus vite mais le 130V est relativement classic dans l'institut ou je bosse...

[invitec718404f]

Essaies, peu etre que ça va améliorer même si au final on n'a toujours pas identifié le souci...

[ratafouin]

Bonjour à tous.
J'ai refait des gels hier dont un que j'ai coloré en bleu pour voir la tête de mes protéines.


Désolé pour la qualité de la photo le scanner de l'équipe est HS...

Donc les protéines sont ok jusqu'à une certaine limite qu'on voit bien après ça devient flou... Pourtant le front de migration (un peu épais comme à son habitude) était au niveau de la bande verte du marqueur (tout en bas à gauche...)

C'est comme si le front de migration réel était décalé par rapport à celui que je peux voir avec le bleu de charge...

Désolé pour le double post mais je trouve pas ou supprimer un message...

[invitea74316c7]

Salut,
As tu essayé de faire un nouveau tampon de chargement? le tampon de chargement joue une rôle important dans la migration! Peut être que les petites protéines sont présentes en très faibles quantité ce qui fait qu'on ne les voit pas sur la fin de gel (explication au bol, je précise)

[ratafouin]

J'ai testé 4-5 tampons de charge différents. L'aspect est systématiquement le même...

Et si on regarde bien la photo du gel on voit une sorte de front (trait bleu) avant la fin du gel, là ou s'arrête les protéines sous forme de bandes discrètes...