Bonjour a tous et merci d’avance pour votre aide,
Je me présente : je viens de commencer un postdoc en Californie, et la technique de base de mon labo sont les IHC (immunohistochemistry). Le problème est que je n’ai qu’un peu utiliser cette technique il y a 7-8 ans…et qu’en plus je parle très très mal l’anglais. Il s’avère que mes ICH ne marche pas, ou mal, et que les seuls réponses du lab manager de mon équipe censé me former a cette technique sont des « I don’t know » accompagné d’un soupir…ca commence un peu a me gonfler.
La technique j’utilise est classique : on place des coupes de tissus, issu de bloc de paraffine, sur des lames après les avoirs coupés au microtome. On enlève la paraffine, on rehydrate, on fait l’antigen retrieval (citrate buffer et chauffage au four a micro-onde), incubation avec l’anticorps primaire, puis avec l’anticorps secondaire biotynilé, puis avec les billes de streptavidine-peroxydase, et enfin la révélation avec le « peroxydase substrate kit DAB SK-400 vector lab ». Là je devrais voir mon marquage au microscope… mais il se passe rien, ou a la rigueur une coloration très diffuse et faible.
Ma question est très spécifique : quand il s’agit d’enlever le liquide qui recouvre mes tissus, par exemple enlever le PBS avant de mettre mon anticorps primaire (ou secondaire, ou mes billes de streptavidines, ou le DAB), j’essais d’enlever un maximum de liquide. J’utilise un papier absorbant que je colle contre une extrémité du tissu (le tissu et le papier se touchent a peine, voire pas du toit). Est-il possible que j’assèche trop le tissu et que le liquide résiduel aspiré par le papier « emporte » avec lui, soit l’anticorps primaire, ou le secondaire, ou les billes de streptavidines (j’aspire ainsi le liquide après chacune de ces etapes)? Est-ce qu’il faut laisser une mince pellicule de liquide sur le tissu ?
Merci d’avance pour votre aide.
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