recherche d'un contact par mail avec un laborantin

[Tolistento]

Bonjour,

je me suis récemment inscrit sur ce forum dont j'ai survolé quelques sujets, et je dois dire que je trouve assez impressionnant cette réunion de scientifiques cultivant leur savoir. Pour mon premier message j'aimerai notamment saluer le site qui est vraiment super selon moi.

Bon là n'est pas le sujet.
J'aime les sciences mais je ne suis qu'un simple amateur à la recherche d'informations assez précises. C'est pourquoi j'aimerais prendre contact par mail avec un laborantin qui pourrait répondre à mes questions. J'en ai plusieurs et elles sont assez farfelues je préviens.

Merci d'avance.
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[Tolistento]

ou par messages privés

[TanguyE]

Bonjour,

Je pense que vous pouvez partager vos questions dans ce sujet, une grande partie des intervenants de ce forum ont travaillé et/ou travaillent encore en labo même si ils ne sont pas laborantins (d'ailleurs je pense que ce terme n'est plus trop utilisé de nos jours). Alors à votre clavier

Cordialement

[biseibutsu]

Je suis d'accord avec TangyE... Il faut nous faire partager!
Quand au question farfelus... Pas de problèmes, j'en ai vu et entendu des quantités!
(La meilleur : "Mais, il fallait mettre l'ADN pour la PCR?")

[A voir en vidéo sur Futura]

[noir_ecaille]

On a bien des questions comme la différence biologique entre la viande halal et pas halal

[Tolistento]

Bonjour à tous,

merci de m'avoir répondu. Je prends compte de ce que vous m'avez dis, et je vais donc poser quelques questions.

Voici ci dessous le lien d'une vidéo traitant de l'extraction d'ADN qui me parait intéressante car ce sont des produits du quotidien qui sont utilisés.

http://videos.arte.tv/fr/videos/kit-...--4159480.html

Alors voilà, j'aimerais savoir à partant de l'échantillon obtenue, et en le centrifugeant à plusieurs reprises, que faudrait-il que je fasse pour obtenir de l'ADN pure liquide ?

[TanguyE]

Bonjour,

Ça va pour le moment c'est pas trop farfelu

Clairement cette méthode artisanale ne permet pas d'obtenir de l'ADN pur même avec une centrifugeuse, puisque l'ADN est déjà précipité, il ira se mettre au fond du tube avec les débris cellulaire. En fait pour ne conserver que l'ADN, il faut centrifuger le mélange avant d'ajouter l'alcool afin d'éliminer les débris de cellules, puis récupérer le surnageant et faire précipiter l'ADN. A ce moment là, vous vous trouverez avec une solution plus ou moins propre d'ADN dans de l'alcool. Une nouvelle centrifugation permettra de collecter l'ADN dans le fond du tube. En éliminant le surnageant et en laissant sécher à l'air libre, vous obtiendrez votre ADN qu'il faudra reprendre dans de l'eau milliQ/ultrapure.

En espérant avoir été assez clair.

[noir_ecaille]

Pas sûr que l'ADN "surnage" sans gradient de densité, sans compter que ses protéines vont obligatoirement précipiter, non ?

Par contre avec une centrifugation au chlorure de césium, il devient possible d'isoler une strate d'ADN relativement pure, voire d'une taille bien précise.

[biseibutsu]

Yup, il me semble qu'il vaut mieux dénaturer les protéines (phénol/chlorophorme) avant de prélever l'ADN, pour qu'il soit le plus pure possible.
Mais ce ne sont pas des produits que l'on trouve facilement dans le commerce en tout cas, pas le phénol). Quand au chlorure de césium, il faut une ultra-centrifugeuse pour réaliser des gradients de densité il me semble. Difficile de se procurer cela en tant que particulier...
Avec les moyens du bord (et une petite centrifugeuse de paillasse), la méthode de TanguyE est la plus adapté.
Pour résumer : détruire les cellules (qui ont été lavées dans un tampon) à l'aide d'un détergeant (SDS trouvable dans le commerce?), faire une première centrifugation courte pour faire descendre tout les débris cellulaires, prélever le surnageant (où il y a l'ADN et des protéines), puis faire précipiter l'ADN à l'aide d'Ethanol et d'acetate de sodium. Laisser reposer sur la glace 15min avant de centrifuger le plus vite possible (14000g) 30min. Enlever le surnageant, faire secher le culot (sous une lampe par exemple) et reprendre l'ADN dans un (petit) volume d'eau distillé. A conserver à +4 ou -20°C.
A part le détergeant (je n'en sais vraiment rien) et la centrifugeuse, tout le reste est trouvable dans le commerce.
L'ADN sera comme même contaminé par des protéines, quoique tu fasses (à part les colonnes de purification...).
Avoir de l'ADN purifié, c'est bien beau, mais ce n'est pas utile (voir pas du tout pour un particulier). Si ce n'est pas indiscret, tu vas en faire quoi ensuite, de cet ADN?

[toothpick-charlie]

on trouve des petites centrifugeuses à un prix relativement abordable (autour de 1500 euros quand-même) notamment chez Eppendorf, mais je ne sais pas si un particulier peut en acheter. Il ne serait pas aberrant que ce matériel soit soumis à règlementation... mais à mon avis le gros problème avec l'extraction d'ADN "à la maison" c'est les contaminations. Chez nous, malgré les précautions prises, ce n'est pas du tout rare alors dans une cuisine...

[Tolistento]

Sérieusement je tiens à vous remercier pour vos explications. Je ne comprends pas tout mais je le gros de ce vous dites me semble être saisi.

Je voudrais savoir, même si l'ADN n'est pas pure, est-il quant même possible de l'analyser pour en déterminer son séquençage ?
Et si en début d'expérience on avait mis dans le verre la salive de plusieurs personnes, serait-il possible de dissocier clairement l'ADN de chacune d'entre elles ?

PS: Et pour te répondre biseibutsu très franchement je ne ferais pas ces expériences. Mais vos réponses me sont quant même utiles! J'ai juste des devoirs à faire sur lesquels il faut que j'apporte des informations scientifiques c'est pour ça que je me tourne vers vous. Pour les autres thèmes ne touchant pas aux sciences je vais voir ailleurs. Je n'ai pas à être aussi précis mais ça m'intrigue.

[noir_ecaille]

Vu la composition des gels de migration et le coût des enzymes pour digérer l'ADN, ça ne me semble pas séquençable à la maison -- d'autant que ça prend énormément de temps, ou alors faut avoir de bonnes bécanes en réseau pour effectuer l'analyse automatisée.

Le tampon de migration surtout est toxique. L'acrylamide, bah... c'est aussi toxique. Quant aux révélateurs, c'est pire. Même en essayant de faire plutôt avec la fluorescence de l'ADN sous lampe UV, ça reste du domaine de la fiction de séquencer de l'ADN chez soi.


Autrement, pour avoir assez d'ADN, il faut soit l'amplifier par PCR (cas de la salive sur le verre) seulement c'est coûteux et surtout pas disponible en superette, soit en disposer en grande quantité (ris de veau par exemple).


Derniers points :
- pour le détergent, il est possible d'utiliser du produit vaisselle dilué à défaut de SDS
- ça marche moyen avec l'éthanol (vaut mieux du méthanol, j'ai déjà eu des ratés en TP), donc le prendre absolument à 100° et pas les autres dilutions

[Tolistento]

Cette vidéo parait mieux: http://www.gene-abc.ch/fr/le-genie-g...a-cellule.html

Une électrophorèse serait possible dans le cas où j'aurai voulu confronter les ADN non ?

Et qu'est-ce qui permettrait de mettre sous forme liquide la pelote d'ADN ?

[TanguyE]

Une électrophorèse serait possible dans le cas où j'aurai voulu confronter les ADN non ?

En fait il n'y a pas moyen de différencier votre ADN du mien juste par électrophorèse. L’électrophorèse ne permet que de séparer des fragments d'ADN selon leur longueur (qui est proportionnelle à leur charge d'où les différences de migration sous l'action d'un champ électrique). Pour différencier l'ADN de deux individus, il n'y a pas 36 solutions, il faut le séquencer (évidemment pas le génome en entier, c'est pas utile).

Et qu'est-ce qui permettrait de mettre sous forme liquide la pelote d'ADN ?

De l'eau distillée devrait faire l'affaire.

vaut mieux du méthanol

Le méthanol est banni dans de nombreux labos en raison de sa toxicité, d'autant qu'il peut être remplacé facilement par de l'éthanol 100% dans un bon nombre d'applications.

[biseibutsu]

Oula, TanguyE, je ne suis pas d'accord

Pour différencier l'ADN de deux individus, il n'y a pas 36 solutions, il faut le séquencer (évidemment pas le génome en entier, c'est pas utile).

Avant même que l'on commence à séquencer tout ce qui nous tombe sous la main, on était déjà capable de différencier l'ADN d'un individu de celui de plusieurs dizaines de millions d'autres (milliards, aujourd'hui). Grace au mini ou micro-satellite. Ce sont de petites séquences d'ADN répétés un certain nombre de fois. Ce nombre est variable suivant les individus, et comparer plusieurs régions en possédant (sur différents chromosomes) permet d'affiner les résultats.
Il n'est même pas obligatoire de réaliser une PCR, et il est possible de ne travailler qu'avec des enzymes de restriction. M'enfin, la PCR est comme même un outil indispensable pour accélérer et simplifier le protocole...
Quand au gel, un simple gel d'agarose fait l'affaire, le tampon de migration phosphate est bon aussi. je crois qu'il est également possible de marquer l'ADN à l'aide de nitrate d'argent (vieux matériel photographique). Bref, à part l'étape de PCR, tout est théoriquement faisable dans la cuisine (ultra-propre pour éviter les contaminations )
Faire une électrophorèse seule ne permet pas de différencier un ADN A d'un ADN B (même si c'est l'ADN humain et l'ADN d'une fougère...). il faut soit digérer l'ADN à l'aide d'enzyme de restriction (comme l'a dit noir-ecaille), soit utilisé la PCR pour amplifier certaine séquence (comme l'a dit TanguyE).

Pour l'éthanol, au labo, on en a deux sortes. L'éthanol 100% classique (en fait 99%), que l'on utilise pour les tampons etc... Et l'éthanol ultra pure (99,999% certifié) pour les manips les plus précieuses (précipitation de l'ADN par exemple). Et je confirme que le méthanol est de moins en moins utilisé, à cause des coups de son élimination (toxique, donc pas dans l'évier!)

[TanguyE]

Oula, TanguyE, je ne suis pas d'accord

Ouaip t'as raison je suis pas d'accord non plus avec moi même... Va falloir penser à augmenter la dose de caféine

Avant même que l'on commence à séquencer tout ce qui nous tombe sous la main, on était déjà capable de différencier l'ADN d'un individu de celui de plusieurs dizaines de millions d'autres (milliards, aujourd'hui). Grace au mini ou micro-satellite. Ce sont de petites séquences d'ADN répétés un certain nombre de fois. Ce nombre est variable suivant les individus, et comparer plusieurs régions en possédant (sur différents chromosomes) permet d'affiner les résultats.
Il n'est même pas obligatoire de réaliser une PCR, et il est possible de ne travailler qu'avec des enzymes de restriction. M'enfin, la PCR est comme même un outil indispensable pour accélérer et simplifier le protocole...
Quand au gel, un simple gel d'agarose fait l'affaire, le tampon de migration phosphate est bon aussi. je crois qu'il est également possible de marquer l'ADN à l'aide de nitrate d'argent (vieux matériel photographique). Bref, à part l'étape de PCR, tout est théoriquement faisable dans la cuisine (ultra-propre pour éviter les contaminations )
Faire une électrophorèse seule ne permet pas de différencier un ADN A d'un ADN B (même si c'est l'ADN humain et l'ADN d'une fougère...). il faut soit digérer l'ADN à l'aide d'enzyme de restriction (comme l'a dit noir-ecaille), soit utilisé la PCR pour amplifier certaine séquence (comme l'a dit TanguyE).

Je confirme!

[toothpick-charlie]

Une électrophorèse serait possible dans le cas où j'aurai voulu confronter les ADN non ?

j'ai l'impression que tu n'as pas bien compris à quoi servait l'électrophorèse. Si tu essaies de faire migrer ton ADN "brut d'extraction" tu n'obtiendras rien d'intéressant. Il te faut d'abord le découper en morceaux (enfin, c'est une des méthodes possibles) à l'aire d'enzymes qui coupent en certains sites bien particuliers. Les mutations peuvent faire disparaître certains de ces sites, ou bien changer la longueur du morceau entre deux sites donnés, et l'électrophorèse permettra de distinguer ces morceaux de taille différente de l'attendu. Regarde ici une description plus précise : http://fr.wikipedia.org/wiki/Polymor...de_restriction

[Tolistento]

Mais comment à partir d'une pelote d'ADN pourrait-on déterminer des micro-satellites ?


PS:Tu as raison toothpick-charlie
je n'ai pas très bien compris le principe de l'électrophorèse. En lisant ton lien je crois saisir un peu mieux: l'ADN est sectionnée en de multiples zones, et lors de l'électrophorèse les fragments d'ADN vont migrer chacun à leur rythme ce qui va créer une sorte de code barre, et si deux codes barres sont identiques c'est que leur ADN l'est aussi, c'est ça ??

[biseibutsu]

On détermine les micro-satellite de l'ADN à l'aide de technique de digestion (comme tu le dis toi même, en coupant l'ADN aux bons endroits), ou de PCR (amplification des centaines de milliers à des millions de fois d'un petit fragment, le microsatellite), puis on fait migrer l'ADN sur gel, révélation (aux UV généralement), et hop, on a nos différentes barres. Ensuite, comme tu le dis, tu compares le profil génétique d'une personne avec celle d'une autre de la même manière. Si TOUTE les barres sont identiques (le code barre, comme tu l'appelles) alors il y a correspondance et on estime qu'il s'agit du même individu.

Je précise également que la pelote d'ADN (séché au fond du tube, on peut la voir facilement), il s'agit en fait de l'ADN de millier de cellules. Même si c'est fragile dans ce cas (il agitation trop forte risque de casser l'ADN aléatoirement), le nombre de copie permet généralement de compenser ces problèmes.

Quand au fait de pouvoir séparer l'ADN de plusieurs dans un même échantillon, cela n'est pas possible avec les techniques dites classiques. Avec un séquençage de troisième génération (séquençage plus rapide et avec moins de matériel génétique), cela doit être possible, et encore, probablement difficile. Cependant, les techniques d'isolation de cellules une à une, puis d'analyse de leur ADN (par PCR, avec analyse des micro-satellites) sont les techniques de demain (et même d'aujourd'hui dans certain labo).

[Tolistento]

Étant donné que l'on sait quels types d'amorces on utilise lors de la PCR on sait quel gènes vont êtres amplifiés c'est ça ?
Et pareil pour les enzymes de restriction, du fait quelles sectionnent l'ADN en des lieux spécifiques ont sait lesquels seront coupés ?

Sous quel état doit se trouver l'ADN lorsqu'on cherche à l'amplifier ?

[Tolistento]

Plus personne ?

[biseibutsu]

Ah, tiens, je n'avais pas vu (ou pas fait attention )

Étant donné que l'on sait quels types d'amorces on utilise lors de la PCR on sait quel gènes vont êtres amplifiés c'est ça ?

Réponse : oui, normalement.
il y a quelques exceptions avec les PCR à amorces dégénérés. Mais je pense que cette méthode ne se fait plus.
En bref, un PCR, c'est un grand morceau d'ADN, des amorces, petites (20 nucléo), qui correspondent généralement à une séquence précise du grand morceau d'ADN et tout ce qu'il faut pour faire de l'ADN (nucléotide, enzyme, cycle...). On amplifie alors l'ADN compris entre les deux amorces, généralement des dizaines de milliers à des millions de fois (cela va très vite!). L'ADN amplifié peut faire 50-200 pb (qPCR, analyse génétique) ou plus de 2000-3000pb. Plus, c'est faisable, mais plus risqué (erreur de la polymérase).
Une PCR à amorce dégénéré utilise une amorce connue, et une autre plus longue, dite dégénéré, qui est capable de se fixer à un peu toute les séquences. On est ainsi capable d'amplifier une séquence inconnue. Que l'on peut ensuite séquencer, refaire des amorces, et recommencer. Mais cette technique a perdue une grande part de son intérêt depuis les programmes de séquençage massif (et heureusement!).

Pour les enzymes de restrictions, on sait qu'elles sont les séquences qu'elles reconnaissent. Pas forcément celle qu'elle coupe. Il y a une petite nuance, mais qui existe, certaine enzyme de restriction étant capable de couper l'ADN à plusieurs dizaines paires de bases de leur lieu de reconnaissance. Généralement, lorsque l'on utilise une enzyme de restriction commune, on ne parle pas d'où elle coupe (car elle peut aussi des fois ce tromper) mais à quelle fréquences elle coupe en moyenne. Tout les 200pb? Ou toute les 4000pb? C'est surtout ceci qui est regardé. Et aussi si elle coupe ou non dans notre région d’intérêt.

Enfin, pour une PCR ou une digestion par enzyme, l'ADN doit pouvoir être accessible. Donc il ne doit pas être condensé sous forme de chromosome, mais sous forme que j'appelle "libre", sans protéines (celle-ci pouvant perturber les réactions enzymatiques), ou le moins possible.

[Tolistento]

Ok d'accord.
Imaginons maintenant qu'en début d'expérience 5 personnes déposent chacune leur salive dans leur tube ( tubes A,B,C,D,E ) ainsi qu'un tube Z où pour le coup ce sont les 5 salives qui y sont mélangés. Puis qu'on fasse la même expérience que celle citée plus haut ( http://www.gene-abc.ch/fr/le-genie-g...a-cellule.html ) pour les 6 tubes. Qu'après on procède à des digestions enzymatiques pour chaque tubes et qu'on termine avec une électrophorèse.

Est ce que le "code barre" associé au tube Z ne sera qu'une sorte de superposition des "codes barre" associé aux tubes A,B,C,D,E ? Ce qui pourrait ainsi confirmer que le tube Z est bel et bien constitué des ADN de chacun des autres tubes.

PS: désolé pour mon emploi de termes peut scientifique lol.

[biseibutsu]

Je ne peux pas ouvrir le lien, mais même sans je pense pouvoir comprendre.
Dans ce cas, la réponse est oui, il va y avoir superposition des bandes pour le tube Z. Et on sera bien embêter si on veut pouvoir dire que telle bande appartient à telle ADN, et donc personne (en fait, c'est impossible juste avec le tube Z).
Si on remplace dans un contexte scientifique sérieux, il n'y a pas suffisament d'ADN dans un crachat pour pouvoir réaliser une telle expérience (digestion+électrophorèse). Une PCR me semble plus convenir. Mais cela donnera le même résultat : on ne sera pas capable de dire le nombre de personne et qui a qui est l'échantillon dans le tube Z.

[Tolistento]

Mais une personne, à qui on ne montre que le résultat de l'électrophorèse, pourra déduire que l'ADN du tube A est aussi présent dans le tube Z de même que le sont aussi ceux des tubes B,C,D,E non ?

[biseibutsu]

Par raisonnement logique, oui.
Par traitement informatique, la marge d'erreur risque d'être importante. En cause, le chevauchement de bandes. Admettons que l'amplification du micro-satellite 1 (exemple) du tube A donne 3 bandes de tailles différentes (50, 100 et 150). La même amplification pour l’échantillon B donne 40, 100 et 180. Dans le tube Z, on trouvera donc 40, 50, 100 (x2), 150 et 180. Comme cela, on peut en déduire que dans le tube Z, il y a l’échantillon A et B. Mais plus on en rajoute, plus il peut devenir difficile de l'affirmer, d'où des probabilités qui se cassent la figure (si C donne 40, 120 et 150 par exemple). Ce qui amène également un autre problème. Si on rajoute un échantillon F dans le tube Z, on ne pourra pas identifier son ADN au complet (tout les micro-satellites) à cause de ces bandes identiques. Mais je cherche la petite bête.

[Tolistento]

L'amplification de seulement 3 micro-satellites suffiraient à confondre l'ADN du tube A de celui de l'un des tube Z ?

[biseibutsu]

Je n'en sais rien avec 5 individus...
En médecine légale, une analyse génétique se fait sur 13 micro-satellites.

[Tolistento]

J'imagine qu'en médecine légale ils se doivent de multiplier le nombre de micro-satellites pour être le plus fiable possible.

Et sais tu combien de temps ,environs, prendrait le fait de faire une extraction d'ADN, une PCR, puis une électrophorèse ?

[biseibutsu]

Les trois étapes que tu indiques prennent généralement moins 36H.
Le plus long est l'étape d'extraction de l'ADN, car il faut un temps d'attente d'une nuit (environ 16h). Puis l'extraction en elle même n'est pas spécialement longue (2-3h). Dans mon ancien labo, on préférait que l'ADN se re-suspendre après purification sur la nuit également, à 4°C, mais cela n'est pas obligatoire. Une PCR classique (20-30 cycles) dans ce cas là doit prendre environ 2min par cycle, donc 1H-1H30 de temps de PCR, plus 30min de préparation. Idem pour la migration. Je tombe à 23H en étant le plus rapide possible, et avec une nuit d'attente.
Cependant, les méthodes d'aujourd'hui permettent (parfois) de sauter l'étape d'extraction de l'ADN. On passe directement à l'étape de PCR, où les cellules sont lysées et l'ADN libéré lors de la première étape. On peut donc diminuer ce temps à 6H (voir même à 4H en étant -très- pressé).
L'assurance est de 1/100 milliards, si je ne me trompe pas.
Enfin, ça, c'est la théorie. Si il y a contamination de l’échantillon avec l'ADN d'une autre personne (autre suspect ou du manipulateur par exemple), il est impossible de le confirmer. Il faudra refaire les analyses.