Manipulation de laboratoire - Extraction d'ARN

[Giulialowa]

Bonjour,


Je ne sais pas si le Forum est vraiment adapté pour ce genre de question mais dans le désespoir j'essaye quand même ^^
Je réalise un mémoire sur les ménisques. Ce sont de petits éléments fibro-cartilagineux (en forme de croissants) qui se situent entre le fémur et le tibia.
J'étudie l'effet des corticostéroïdes utilisés pour traiter l'ostéoarthrite sur ces ménisques. Dans mes manipulations, je tente d'extraire l'ARN des cellules méniscales dans le but d'analyser si des gènes tels que ceux du collagène ou de l'aggrecan subissent une modification de leur expression.

Voilà les détails. Maintenant, en pratique, j'extrais l'ARN en utilisant le protocole du Tri-Réagent (par Sigma-aldrich). Mon problème est tout à la base de la manipulation: je n'arrive pas à transformer les ménisques en "solutions". J'ai tenté de les mettre dans l'azote liquide et de les broyer avec un pilon mais ils sont tellement dur que ça durcit encore plus mais ça ne se casse pas en poudre. J'ai aussi essayé de les digérer avec de la Papaïne mais je viens d'arriver au bout de la manipulation (RT-qPCR) et je n'ai pas de résultats. Tout semble contaminé. Je me dis donc que peut-être la papaïne abîme l'ARN.

Toujours est-il que je ne trouve pas de solution pour transformer les échantillons solides en liquides. Auriez-vous une idée? Je sais qu'il existe un appareil appelé TissueLyser II mais malheureusement je n'ai pas de budget pour en acheter un.

Merci beaucoup pour votre aide,
Giulia
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[Loupsio]

Bonjour,
Tu n'as pas de moelle a l’intérieur du ménisque ou il serait plus facile d'extraire? il suffirait de couper l'os, de récupérer la moelle et mettre directement dans l'azote liquide. Car pour de l'os il semble evident que le moyens le plus simple serait par traitement chimique pour ramollir l'os, mais ca dégraderait tes ARN donc t'as pas beaucoup de choix restants

Sinon si la moelle ne convient pas pour ta manip, et que l'azote liquide ne marche pas, tu peux essayer quelque chose de plus froid encore
L'azote liquide est le principal truc utilisé car il possède une différence entre la T° de fusion et T° d'ébullition relativement écarté ce qui est préférable pour des utilisation en routine, mais tu as des liquides plus froid que l'azote, tu peux peut-être utiliser un de ceux là et le fait d'amener ton échantillon a une température très basse devrait le fragiliser et il devrait se casser plus facilement.
Tu as par exemple l'hydrogène liquide qui est à -250 , l'hélium liquide qui est à -260
pour comparaison, l'azote liquide c'est -190 normalement
Mais j'ai jamais utilisé autre chose que l'N liquide, renseigne toi au cas ou que ca puisse t'être utile

[Giulialowa]

Il n'y a pas de moëlle dans le ménisque.
Merci néanmoins de ta réponse, je vais me renseigner si au labo nous n'avons pas un liquide plus froid que l'azote.

Bon weekend

[vinssss]

Bonjour,

Est ce qu'il y a de l'ARN à extraire au moins?

[A voir en vidéo sur Futura]

[Giulialowa]

Bonjour,


En théorie oui, il y a des cellules (en faible densité) qui produisent toutes sortes de constituants de la matrice extracellulaire à l'intérieur (comme par exemple le collagène).