Technique de RACE-PCR?

[aaricia8]

Bonjour à tous,
Je suis étudiante en Master 1 SVT et la biotechnologie n'est pas mon fort! J'ai vu des post sur la PCR ou RT-PCR, mais moi c'est avec la RACE-PCR que j'ai des problèmes... J'ai compris le but (compléter rapidement les extrémités des ARNm), mais la technique m'échappe complètement! Pourriez-vous m'expliquer comment ça marche? (Même sans tous les détails, juste le gros!)
Merci d'avance, je suis complètement à l'arrache dans mes révisions!

[gorben]

Citation:

Posté par aaricia8

J'ai compris le but (compléter rapidement les extrémités des ARNm),

Salut
Non, le but ce n'est pas ca. le but de la RACE PCR est de determiner les extremité 3' ou 5' des ARNm.

Pour la RACE en 3', tu va utiliser la queue polyA en 3' d'un ARNm pour hybrider un oligo dT qui va te servir a amorcer la RT-PCR, sur l'ADNc correspondant tu fais ensuite une PCR avec un oligo gene specifique (sens forward) et ton oligo dT. Ensuite, tu clones ton produit PCR, tu le fais sequencer et tu as la position exacte du stop de terminaison.

Pour la RACE en 5', le principe est le meme sauf que tu fabriques une "queue polyA" grace à une terminale transferase.

Voila, j'espere avoir été clair.
A+

[aaricia8]

Bonjour Gorben, tout d'abord merci de ta réponse rapide!

Alors, je résume : Pour la 3' RACE, l'amorce utilisée pour la RT est un oligo dT, afin qu'il s'hybride avec la queue poly A de l'ARNm, on a donc ainsi toute l'extrémité 3' de l'ARNm.

Mais j'ai un soucis pour la PCR qui vient ensuite : est-ce que la sonde qui sert à l'initier se fixe sur l'oligo dT? Elle serait donc forcément poly A, non? La sonde ne devrait-elle pas se fixer à l'extrémité 3' de l'ADNc, qui ne contient pas de séquence poly A ou oligo dT? Et je ne sais pas ce qu'est le sens forward (je dois vraiment avoir des lacunes... )

L'amorce en ce qui concerne la PCR après 5' RACE serait donc aussi toujours (du moins pour cette extrémité) poly A?

Désolée pour toutes ses questions supplémentaires, je pense avoir au moins compris le but de la manip maintenant, c'est déjà bien! Mais j'ai vraiment du mal à comprendre toutes ses techniques, ça me semble tellement abstrait!

Je suis preneuse de toutes explications!! Encore merci Gorben, A+

[gorben]

salut

J'ai fais une erreur, ton gene specifique est dans le sens reverse (c'est a dire qu'il est reverse complementaire a la sequence sens de ton ADN).

Pour la RACE en 3', represente toi les brin et les oligos sur un schema en nottant bien l'orientation des brins.

La queue polyA initialement en 3' de ton ARN est passée en 5' de ton ADNc. Si tu hybrides sur cet ADNc un oligo gene specifique, lors de la premiere etape de PCR, cet aoligos va se contenter de fabriquer le 2eme brin d'ADN (le brin complementaire de ton ADNc). Tu vas donc avoir en 3' de ce nouveau brin une sequence polyA sur laquelle hybrider ton oligo dT.

Pour la race en 5', comme tu n'as pas de queue polyA ou prendre ton oligo, tu vas "manuellement" rajouter la queue polyA (en 5'). Par la suite le principe est le meme.

Fais toi des schemas, ca aide enormement

A+

[aaricia8]

Merci beaucoup!!
La je pense que j'ai saisi!! C'est vrai que les schémas c''est bien utile, et je vois comment les faire maintenant! Je vais pouvoir aller me prendre la tête avec un autre chapitre pour mes révisions!
A bientôt

[anth]

Voici justement un schema de race pcr 5' et 3' .

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv...mg.figgrp.2574

[Aqualung]

Je réactualise le sujet, parce que je comprend bien le fonctionnement mais pas le but... quel intérêt a-t-on de vouloir se retrouver avec des mRNA rognés? Le but est simplement d'avoir une extrémité complète?

[Patfol]

On m'avait dit que ca servait a amplifier le 5' et 3' UTR d'un gène en vue de les analyser.